Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Queremos agradecer e reconhecer o Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson no banco de tecidos do cérebro de UK-ADC para fornecer o cérebro humano todas as amostras de tecido (número de concessão de NIH: P30 AG028383 do Instituto Nacional do envelhecimento). Agradecemos a Matt Hazzard e Tom Dolan, serviços de tecnologia da informação, tecnologia acadêmica e engajamento de professores, Universidade de Kentucky para assistência gráfica. Este projecto foi apoiado pelo 1R01NS079507 número da concessão do Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso (para B.B.) e 1R01AG039621 número de concessão do Instituto Nacional sobre o envelhecimento (para A.M.S.H).. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e derrame ou do Instituto Nacional sobre envelhecimento. Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

As informações abaixo baseia-se na atual segurança e as normas reguladoras da Universidade de Kentucky, Lexington, KY, EUA. Como uma precaução de segurança, consulte programa de segurança biológica da instituição e as mais atuais regulamentos e recomendações antes de trabalhar com tecido humano.
Atenção: O tecido humano pode ser uma fonte de patógenos transmitidos pelo sangue, incluindo o vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV) e outros. Trabalhar com tecido humano representa o risco de infecção por patógenos transmitidos pelo sangue. Portanto, certas considerações de segurança e regulamentação são imperativas, ao trabalhar com tecido humano para proteger o pessoal de laboratório. Trabalhar com tecido humano nos EUA requer um laboratório de nível 2 de biossegurança, bem como as precauções de segurança e formação de acordo com o NIH seção IV-B-7, OSHA Act de 1970 cláusula 5(a)(1) e programa de institucional de segurança biológica do usuário. Em geral, aprovação do Comitê institucional de biossegurança e/ou Conselho de revisão institucional deve ser obtida antes da realização de qualquer pesquisa envolvendo humanos materiais (tecido, fluidos corporais). O treinamento é necessário para todo o pessoal a trabalhar com materiais humanos e inclui treinamento de segurança do laboratório básico, por exemplo, químicos higiene e segurança do laboratório, bem como formação específica para a segurança biológica, resíduos perigosos e humanos patógenos transmitidos pelo sangue. Todo o pessoal a trabalhar com materiais humanos é altamente recomendado para obter vacinas de hepatite B, antes de trabalhar com materiais humanos. Pessoal é obrigado a usar equipamentos de proteção individual específico enquanto estiver trabalhando com materiais humanos, por exemplo., um jaleco algemado e uma cara de escudo e usando luvas de todos os tempos. Todo trabalho é realizado em uma armário de biossegurança (classe 2). Todos os equipamentos que vem no contato com materiais humanos e qualquer resíduos de materiais humanas é tratado adequadamente para evitar contaminação e/ou infecção do pessoal. Todos os equipamentos e as superfícies são limpas com 10% de etanol água sanitária e 75%, após cada procedimento envolvendo materiais humanos. Um derramamento com materiais humanos deve ser imediatamente limpas. Produtos vidreiros é esterilizado após cada utilização. Resíduos, incluindo os tecidos humanos não fixado, são coletado em um saco de resíduos de risco biológico rotulado e esterilizada. Farelos são coletados em um recipiente de punção e estanques rotulado como de risco biológico. Todos os resíduos de materiais humanos é Descartado de acordo com regulamentos de segurança biológica da instituição.
Nota: Nosso laboratório obtém amostras frescas córtex frontal de indivíduos falecidos, através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M). Critérios de inclusão são: inscrição no estudo de coorte longitudinal autópsia UK-ADC e um intervalo Post-Mortem (PMI) ≤ 4 h64. Autópsias sigam um protocolo padrão e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen65. Um PMI curta de menos de 4 h é da maior importância para assegurar a viabilidade capilar depois de isolamento. Tecido fresco e congelado pode ser usado. Se o congelamento for necessário, tecido cerebral humano recentemente obtidos deve ser choque congelado em nitrogênio líquido e armazenado a-80 ° C. Tecido fresco ou descongelado deve ser armazenado no buffer de isolamento (veja abaixo) e processado rapidamente. Encontramos esse 10 gramas de tecido humano fresco rende cerca de 100 mg de capilares de cérebro (peso úmido).
1. instalação
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Preparação do amortecedor Nota: O volume de reserva necessária depende da quantidade de tecido. Todos os volumes de tampão no protocolo a seguir baseiam-se 10 g de tecido do córtex cerebral humano.<ol>
<li>L isolamento Buffer: Usar 1,5 L de fosfato salino de Dulbecco (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 milímetros de NaCl, Na2HPO4de 8,1 mM, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) e completar com 5 mM D-glicose (1,35 g ) e piruvato de sódio 1 mM (0,165 g). Depois de adicionar a glicose e piruvato, ajuste o pH 7,4 com hidróxido de sódio. Esfriar e guarde o buffer de 4 ° C antes de usar.</li>
		<li>Albumina de soro bovino (BSA): Adicione 10 g de pó de BSA a 1 L de tampão de isolamento para uma concentração final de BSA de 1%. Mexa lentamente para evitar bolhas, ajustar o pH 7,4 e armazenar a 4 ° C durante a noite. Imediatamente antes da utilização, misture suavemente; Evite a formação de bolhas para evitar a desnaturação da albumina.</li>
		<li>médio de gradiente de densidade: pesar 18 g de médio gradiente de densidade para um frasco de vidro e adicionar uma barra de agitação magnética. Adicione 60 mL de tampão de isolamento e agitar vigorosamente por 5 min até todo pó é suspenso. Loja durante a noite a 4 ° C, para permitir que o meio de gradiente de densidade dissolver. Mexa por 10 minutos antes do uso.</li>
		<li>Armazenar todos os buffers a 4 ° C; manter todas as ferramentas e buffers no gelo durante o procedimento de isolamento inteira. Misture todos os buffers antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Instalação experimental
	<ol>
<li>Monte o pilão do moinho Potter-Elvehjem tecido para o misturador eletrônico de sobrecarga. Coloque o moedor de tecido Potter-Elvehjem e o homogenizacao homogenizador com pilão no gelo sob o capô. Preparar uma malha de filtro de 300 µm (5 x 5 cm2), dobre-o para um cone e inserir e anexá-lo a um 50 mL tubo Falcon com fita (figura 1A).</li>
		<li>Coloque anéis conexão e filtros de tensão da pilha (tamanho de poros: 30 µm) em tubos Falcon de 50ml. Prepare os sacos de resíduos de risco biológico. Coloque equipamentos necessários na biossegurança do armário (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação da amostra cérebro
Nota: A figura 1A mostra o gráfico de fluxo de trabalho do processo de isolamento todo descrito abaixo. Tecido cerebral humano pode originar-se de qualquer parte do córtex e pode ser usado fresco ou congelado. Tecido de cérebro congelado pode ser descongelado à temperatura ambiente (nenhum buffer; ~ 30 min para 10 g). Para obter resultados comparáveis, o tecido cerebral deve ser obtido com a mesma região do cérebro para cada experimento. Este protocolo é otimizado para fresco (PMI < 4h) córtex cerebral humano que não tenha sido congelado.
<ol><li>Preparação do tecido do cérebro humano: documentar o peso do tecido cerebral. Todos os números do protocolo a seguir são apropriados para 10 g de tecido cerebral humano fresco. Coloque o tecido cerebral em uma placa de Petri de 100mm. Cuidadosamente, remova todas as meninges com fórceps. Use um bisturi para cortar a massa branca.</li>
	<li>Picagem de tecido do cérebro humano: corte o tecido do cérebro com cuidado e piquem-o com um bisturi. Carne moída por cerca de 5 min (pedaços de 2 a 3 mm). Transferi o tecido cerebral para o Potter-Elvehjem moedor de tecido. Adicione 30 mL de tampão de isolamento. Nota: As peças de tecido picada são difíceis de ver, desde que o tecido cerebral se transforma em mingau através do processo de picagem.</li>
</ol>3. a homogeneização
<ol><li>Moedor de tecido Potter-Elvehjem (autorização: 150 – 230 µm): homogeneizar cada amostra com 100 golpes à velocidade de 50 rpm homogenizador. Documente o tempo cada 25 traços e o tempo total necessário para 100 traçados. Consulte a tabela 1 para um protocolo proposto homogeneização; o tempo total para homogeneização de 10 g de córtex frontal humano é cerca de 22 min. Não mexa no ar para evitar bolhas.</li>
	<li>Homogenizador homogenizacao (autorização: 80-130 µm): transferir o homogeneizado para um homogenizador homogenizacao no gelo. Homogeneizar a suspensão com 20 golpes (~ 6 s/curso, total de ~ 2 min). Evite bolhas.</li>
</ol>4. centrifugação
<ol><li>Distribua o cérebro homogenate igualmente em quatro tubos de centrifugação de 50 mL e o volume total do homogenate de documento. Distribua 50 mL de tampão de gradiente de densidade para os tubos de centrifugação (12,5 mL por tubo). Use 10 mL de tampão de isolamento para enxaguar o pilão e homogenizador e distribuir para os quatro tubos de centrifugação (~2.5 mL por tubo).</li>
	<li>Feche os tubos de centrífuga com tampas. Misture o homogeneizado, médio gradiente de densidade e tampão agitando vigorosamente os tubos. Centrifugar a 5.800 x g durante 15 min a 4 ° C (rotor de ângulo fixo); Seleccione uma velocidade de desaceleração média para manter o sedimento ligado ao tubo. Desprezar o sobrenadante e ressuspender cada em 2 mL de 1% de BSA.</li>
</ol>5. filtração
Nota: Para separar os capilares de glóbulos vermelhos e outros detritos celulares, são necessárias várias etapas de filtração.
<ol><li>300 µm de malha: após a re-suspensão a pelota, filtrar a suspensão através da malha de 300 µm. Os capilares são filtrados através da malha, que navios maiores e restos de cérebro maiores continuam na malha. Lave cuidadosamente a malha com até 50 mL de 1% de BSA. Descarte a malha. Nota: Esta etapa de filtração limpa a suspensão capilar de qualquer maiores navios ou pedaços de detritos de cérebro.</li>
	<li>
Filtro de tensão de célula 30 µM Nota: Esta etapa de filtração separa capilares de glóbulos vermelhos e outros restos de cérebro.<ol>
<li>Distribua o filtrado capilar da etapa 6.1 sobre os filtros de tensão de célula de cinco 30 µm (cerca de 10 mL do filtrado capilar por filtro de tensão de célula). Os capilares estão retidos por este filtro, Considerando que as células vermelhas do sangue, outras células únicas e restos de cérebro pequeno passam através do filtro e são recolhidos no filtrado.</li>
		<li>Lave cada filtro com 25 mL de 1% de BSA. Depois, despeje todos os filtrados sobre o sexto filtro para aumentar o rendimento. Lavar cada filtro com 50 mL de 1% de BSA; manter a célula estirpe filtros com contendo os capilares e descartar o filtrado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. coleção capilar
<ol><li>Vire os filtros e lave os capilares com 50 mL de 1% de BSA para cada filtro em tubos de 50 mL. Levemente aplique pressão com a ponta da pipeta de uma pipeta de 5 mL e movê-lo do outro lado do filtro para lavar os capilares do cérebro.</li>
	<li>Certifique-se de lavar todos os capilares do cérebro, especialmente a partir da borda do filtro. Evite bolhas, pois isto dificulta o processo de filtração e aumenta a chance de perda capilar.</li>
</ol>7. lavar roupa
<ol><li>Depois de coletar os capilares, centrifugue todas as amostras a 1.500 x g durante 3 min a 4 ° C (balançando o balde do rotor). Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em aproximadamente 3 mL de tampão de isolamento. Combine todos os chumbos ressuspensão de uma amostra em um tubo cônico de 15 mL e preenchê-lo com o tampão de isolamento. Centrifugar novamente a 1.500 x g durante 3 minutos a 4 ° C e lavar duas vezes mais.</li>
	<li>Documente a pureza capilar com um microscópio (ampliação de 100 X) e câmera (figura 1B). Nota: O rendimento de cérebro capilar de 10 g de tecido do cérebro humano é geralmente de cerca de 100 mg. Os capilares do cérebro isolado agora podem ser usados para experiências, processadas (ex., lisado, isolamento de membrana), ou ser congelado e armazenado a-80 ° C em cryotubes por um período mínimo de 6-12 meses (evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O presente protocolo descreve o isolamento dos capilares do cérebro humano intacto e viável de tecido fresco. Nesta seção, discutiremos em detalhes a seguir: 1) modificações para o protocolo 2) solução de problemas de erros comuns, 3) as limitações da técnica, 4) o significado do modelo em relação ao existente e modelos alternativos barreira hemato - encefálica, e 5). potenciais aplicações para capilares do cérebro humano isolado.
O protocolo descrito aqui é otimizado para 10...

A barreira sangue - cérebro é uma interface rigidamente controlada entre o sangue e o cérebro que determina o que entra e sai do cérebro. Anatomicamente, células endoteliais compõem a barreira sangue - cérebro e formam uma rede capilar complexa, contínua. Fisiologicamente, essa rede capilar fornece o cérebro com oxigênio e nutrientes ao simultaneamente eliminação de dióxido de carbono e produtos de resíduos metabólicos. Importante, a evidência suporta que as alterações para a barreira contribuam para inúmeras patologias, incluindo a doença de Alzheimer, epilepsia e acidente vascular cerebral1,2,3,4,5 , 6 , 7. cérebro células endoteliais também servem como uma barreira ao tratamento, bloqueando a absorção de drogas no cérebro, por exemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme seguindo tumor ressecção8,9, 10. a este respeito, os capilares do cérebro humano isolado representam um único ex vivo modelo de barreira hemato - encefálica que se assemelha a barreira propriedades in vivo, que permite o estudo da função de barreira e disfunção em saúde e a doença. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para isolar os capilares do cérebro do cérebro humano em um capilar de consistentemente de alta qualidade e rendimento para estudar a barreira sangue - cérebro.
Em 1969, Siakotos et al. 11 foram os primeiros a relatar o isolamento dos capilares do cérebro do tecido cerebral bovina e humana usando densidade gradiente centrifugação e vidro do grânulo coluna separação. Mais tarde, Goldstein et al. 12 melhorado este método adicionando várias etapas de filtração para diminuir a quantidade de tecido necessário para estudar os capilares do cérebro isolados de ratos, mantendo a atividade metabólica de transporte de glicose. Desde então, pesquisadores otimizado o procedimento de isolamento capilar inúmeras vezes, melhorar o modelo capilar método e cérebro com cada iteração13,14,15. Por exemplo, Pardridge et al. 16 isolado bovina capilares usando digestão enzimática, ao invés de homogeneização mecânica e posteriormente passou uma suspensão capilar através de um filtro de malha de 210 µm e uma coluna de vidro do grânulo. Essas modificações melhoraram a mancha de exclusão trypan azul dos capilares do cérebro isolado e assim, aumentaram a viabilidade celular endotelial. No início de 1990, Damasceno et al. 17 isolado bovina e rato capilares que eram claras de contaminação neuronal e mantida a atividade metabólica de γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) e fosfatase alcalina. Em 2000, Miller et al. 18, usado isolado de rato e capilares do cérebro suínos em combinação com microscopia confocal para mostrar o acúmulo de substratos de transporte no lúmen dos capilares. Posteriormente, nosso laboratório tem continuado a otimizar o processo de isolamento capilar do cérebro e nós estabelecemos transporte ensaios para determinar a P-glicoproteína (P-gp)19,20,21, câncer de mama resistência da proteína (BCRP)22,23e proteína de resistência a múltiplas drogas 2 (Mrp2)24 atividade de transporte. Em 2004, publicou dois relatórios onde costumávamos capilares de cérebro de rato isolado para investigar diversas vias de sinalização. Em Hartz et al. 21, encontramos que o peptídeo endotelina-1 reversível e rapidamente reduzida função de transporte de P-gp em capilares cerebrais, actuando através do receptor (ETB) do receptor B de endotelina, óxido nítrico sintase (NOS) e proteína quinase C (PKC). Em Bauer et al . 19, temos demonstrado que a expressão do receptor nuclear receptor pregnane X (PXR) e mostrou PXR-modulação da função de expressão e transporte de P-gp em capilares do cérebro. Em experimentos com ratos transgénicos de PXR humanizados, nós expandidos nessa linha de pesquisa e mostrou na vivo de aperto da barreira por estrogenos P-gp através da ativação de hPXR25. Em 2010, Hartz et al. 26 usado essa abordagem para restaurar a expressão da proteína de P-gp e transportar a atividade em ratos transgénicos precursora amiloide humano proteína (hAPP) overexpress hAPP. Além disso, restaurando a P-gp no hAPP ratos reduziram significativamente níveis de cérebro de42Aβ e beta amiloide (Aβ)40.
Além de estudar a sinalização de caminhos, capilares de cérebro isolado podem ser usados para determinar as alterações na permeabilidade capilar que nos referimos como vazamento capilar. Em particular, o ensaio de fugas de Texas Red é usado para avaliar o escapamento do corante fluorescente Vermelho Texas do lúmen capilar ao longo do tempo e estes dados são usados para analisar taxas de fugas. Taxas de vazamento capilar aumentada em comparação com aqueles dos capilares de controle indicam alterações na integridade física da barreira hemato - encefálica2. Isto é valioso porque existem numerosos estados patológicos associados rompimento da barreira, por exemplo., epilepsia, esclerose múltipla, doença de Alzheimer e cerebral traumática lesão27,28,29, 30. Outros grupos também têm utilizado isolados capilares para discernir as vias de sinalização que regulam a expressão de proteínas e atividade de transporte de proteínas31,32,33,34, 35,36,37. Finalmente, continuamos a otimizar esse método para o isolamento dos capilares do cérebro humano e, recentemente, mostramos a expressão aumentada de P-gp no humana barreira hemato - encefálica, em pacientes com epilepsia, em comparação com indivíduos de controle livre de apreensão38 . Tomados em conjunto, estes desenvolvimentos demonstram que os capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo versátil para estudar a função de barreira.
Vários in vivo, ex vivoe em vitro barreira hemato - encefálica modelos têm sido utilizados em pesquisa básica e rastreio de drogas industriais, principalmente com o objetivo de testar a entrega da droga para o cérebro39,40,41 ,42,,43,44. Além de isolados ex vivo capilares do cérebro, modelos atuais da barreira hemato - encefálica incluem modelos em silico , em vitro cultura celular de células endoteliais capilares do cérebro isolado ou linhas de células imortalizado de vários espécie, em vitro de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) que se diferenciar em células endoteliais capilares do cérebro e microfluidic modelos em um chip.
In silico modelos são mais usados no desenvolvimento de drogas para a seleção de candidatos a fármacos com base no previsto de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) Propriedades. Métodos como modelos de relacionamento (QSPR) estrutura-Propriedade quantitativa e quantitativa estrutura-atividade relação (QSAR) são métodos populares usados na seleção da elevado-produção de bibliotecas para prever a penetração do cérebro de candidatos da droga 45 , 46. estes modelos são úteis para moléculas de tela para propriedades de penetração da barreira.
Betz et al 47 estabeleceu monocamadas de células endoteliais capilares do cérebro culta como um sistema de modelo em vitro barreira hemato - encefálica. Em vitro celular cultura modelos usando tecido fresco ou linhas de células endoteliais imortalizado como células endoteliais microvessel cerebral humana (hCMECs) podem ser outra ferramenta de seleção da elevado-produção para penetração do cérebro ou estudos mecanicistas. No entanto, modelos de cultura de células endoteliais capilares cerebrais faltam a tensão de cisalhamento fisiológico do fluxo de sangue para dentro do lúmen capilar, estão limitados a complexidade geral biológica e se submetem a mudanças na expressão e localização de componentes importante barreira como proteínas de junção apertada, íon, transportadores, enzimas e receptores de superfície canais48,,49,50. Inversamente, monocamadas endoteliais derivado hPSCs, tem permeabilidade de sacarose baixa em comparação com as culturas hCMEC/D3 e conter expressão polarizada de alguns transportadores barreira hemato - encefálica, moléculas de adesão e junções apertadas51, 52. no entanto, essas células também estão sujeitos a alteração de propriedades na cultura, e o sistema deve ser validado para sua recapitulação na vivo Propriedades barreira52.
Mais recentes tendências em pesquisa da barreira hemato - encefálica incluem utilizando sistemas de cultura de tecido 3D para criar capilares artificiais, usando a tecnologia do órgão-on-chip para gerar dispositivos microfluídicos, ou utilizando a tecnologia de fibra oca53, 54 , 55. capilares artificiais, no entanto, têm significativamente maiores diâmetros (100 – 200 µm) do que o cérebro os capilares (3 – 7 µm). Daí, o cisalhamento forças em vitro não totalmente se assemelham a situação na vivo . Esta mensagem é dirigida em dispositivos microfluídicos "blood-brain-barrier-on-a-chip", onde os compartimentos de "sangue" e "cérebro" de forma artificial de membranas e fluidos são bombeados através destes dispositivos, gerando forças de cizalhamento microfluidic. Da mesma forma, co culturas de células de músculo liso vascular e células endoteliais em várias combinações com astrócitos também têm sido usadas com a tecnologia de fibra oca para recriar reológicos parâmetros presentes na vivo condições56 , 57 , 58. no entanto, desconhece-se o quanto este modelo reflete outras propriedades da barreira sangue - cérebro, tais como transporte, metabolismo, sinalização e outros. Estes modelos capilar e chip artificiais são adequados para seleção da elevado-produção de drogas, mas as células usadas para gerar esses modelos também estão sujeitos a alterações durante a cultura.
Fatias de cérebro congelado e fixo ou cerebrais primários, culturas de células endoteliais capilares são modelos adicionais que podem ser usados paraestudar a microvasculatura humana5,59,60,61. Por exemplo, imuno-histoquímica do tecido cerebral fixa é usada para determinar a localização da proteína, e a expressão em saudável em relação ao tecido doente.
Além de fatias de tecido e os modelos em vitro capilares do cérebro descrito acima, recentemente isolados podem ser utilizados para estudar a função da barreira hemato - encefálica. As limitações deste modelo capilar isolada incluem a dificuldade para obter o tecido do cérebro humano fresco, ausência de astrócitos e neurônios e um processo de isolamento relativamente demorado. Uma vantagem do modelo capilar cerebral isolado é que este modelo se assemelha a situação na vivo e, portanto, pode ser usado para caracterizar a função de barreira e disfunção. Importante, ele também pode ser usado para discernir os mecanismos de sinalização usando uma infinidade de ensaios e técnicas moleculares3,19,,62,63.
Nosso laboratório tem acesso a ambos os tecidos frescos e congelados do cérebro humano através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M)64. Neste contexto, as autópsias seguem um protocolo padrão, cérebros são obtidos em < 4h e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen65. Dado este acesso exclusivo ao tecido do cérebro humano, estabeleceu e otimizado um protocolo para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano que resulta em um alto rendimento dos capilares do cérebro humano intacto, viável. Dois pontos de extremidade comuns de interesse são para determinar a expressão da proteína e atividade. A este respeito, nós e os outros estabeleceram vários ensaios que podem ser usados com os capilares do cérebro isolado para estudar a expressão da proteína e níveis de atividade. Estes ensaios incluem mancha ocidental, ensaio de Western simples, ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), zimografia, ensaios de atividade de transporte, e ensaios de vazamento capilar. Estes ensaios permitem aos pesquisadores estudar alterações na função de barreira em condições patológicas humanas, determinar caminhos que regem a atividade e expressão da proteína e identificar alvos farmacológicos para o tratamento da barreira hemato - encefálica associada doenças.
Tomados juntos, recentemente capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo robusto e reprodutível a barreira sangue - cérebro. Especialmente, este modelo pode ser combinado com muitos ensaios diferentes para determinar uma grande variedade de pontos de extremidade para estudar a função de barreira.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Personal Protective Equipment (PPE)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Disposable Protective Labcoats</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td></tr><tr><td>Face Shield, disposable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>19460102</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td></tr><tr><td>Safety Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Paper 18&quot; x 20&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>to cover working areas</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>for used scalpels</td></tr><tr><td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.</td><td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C Refrigerator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscope</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td><td></td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td><td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>used to freeze the tissue?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analytical Balance</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td><td></td><td>used to check isolated capillaries</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools and Glassware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>resuspend pellet in BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>to mince brain tissue</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>to cover beaker and volumetric flask</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>to wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>60 mL syringe with Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>used with connector ring to filter capillaries</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>used for mincing</td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>50 mL volume, clearance: 150-230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL volume, clearance: 80-130 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td></tr><tr><td>pluriStrainers (pore size: 30 &amp;micro;m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Connector Ring</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>41-50000-03</td><td>reuse multiple time</td></tr><tr><td>1 L Volumetric Flask</td><td></td><td></td><td>for preparation of Isolation Buffer</td></tr><tr><td>1 L Beaker</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA</td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Schott Bottle (60 mL)</td><td></td><td></td><td>for preparation of Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td>to keep everything cold</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td></td><td></td><td>for mincing of brain tissue</td></tr><tr><td>Tissue Culture Cell Scraper</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89260-222</td><td>to remove supernatant after centrifugation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraction V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647-500g</td><td>prepare in DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td></tr><tr><td>DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>to adjust pH of the DPBS</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Concentration: 1 mM</td></tr></tbody></table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Função de barreira hemato - encefálica compreensão sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que mantêm a promessa para melhorar a entrega de drogas do cérebro, melhorar a proteção do cérebro e tratar o cérebro transtornos. No entanto, estudando a função humana barreira sangue - cérebro é um desafio. Assim, há uma necessidade crítica de modelos adequados. A este respeito, os capilares do cérebro isolados do tecido do cérebro humano representam uma ferramenta única para estudar a função de barreira, como próximo a situação humana no vivo quanto possível. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar os capilares do tecido do cérebro humano em um alto rendimento e com pureza e qualidade consistente. Capilares são isolados do tecido do cérebro humano fresco usando homogeneização mecânica, gradiente de densidade centrifugação e filtração. Após o isolamento, os capilares do cérebro humano podem ser usados para várias aplicações, incluindo ensaios de vazamento, imagem de célula viva e ensaios baseados em imunológico para estudar a expressão da proteína e função, atividade enzimática ou sinalização intracelular. Cérebro humano isolado capilares são um modelo exclusivo para elucidar o Regulamento da função humana barreira hemato - encefálica. Este modelo pode fornecer insights sobre patogênese do sistema nervoso central (SNC), que irá ajudar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de doenças do SNC.

Os isolamentos de tecido cerebral humano rendem uma suspensão enriquecida nos capilares do cérebro humano (figura 1B) com pequenas quantidades de vasos maiores, glóbulos vermelhos, outras células únicas e alguns detritos de células. Alguns capilares são ramificados, e, em alguns, os glóbulos vermelhos são aprisionados nos lúmens capilares. O capilar típico tem uma 3 – 7 µm de diâmetro e é aproximadamente 100-200 µm comprimento com lúmens abe...

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Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K visualizações.  University of Kentucky. Capilares do cérebro isolado do tecido do cérebro humano podem ser usados como um modelo pré-clínicos para estudar a função de barreira sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano fresco.

Vídeo: Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificação de embarcações do cérebro do rato

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Neurociência

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Cultura de Pericytes Capilares Cerebrais para Medições citosóicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Biologia

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue

Source: Hartz, A. M. S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57346" target="_blank">Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of cerebral capillaries from a fresh human brain tissue. The isolated capillaries can then be used to generate an ex vivo blood brain barrier model.

Isolamento de capilares cerebrais do cérebro humano: um método otimizado para extrair capilares cerebrais do tecido cerebral humano

Source: Hartz, A. M. S. et al. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pesquisa do câncer

Câncer do Sistema Nervoso

Estudos ex vivo

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Isolamento e Cultura de Pericitos Cerebrais Primários: Um Procedimento para Isolar e Cultivar Pericitos de Capilares Cerebrais Bovinos Sem Contaminação de Células Endoteliais

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...

Estudos in vitro

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

Source: Nielsen, S. S. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56277">Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

Purificando capilares de um cérebro suíno

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Purification of Porcine Brain ...

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

Um método para o isolamento de unidades neurovasculares do cérebro de ratos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...