Name: isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles at JoVE.com

Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

1. Kanül ve Odası Hazırlık <ol><li> (Dış çap: 1.2 mm; iç çapı: 0.69 mm, uzunluğu 10 mm), temiz borosilikat cam kılcal takın bir platin filaman (100 um çapında), bir pipet çektirmenin oluklara. </li><li> Uygun ayarları kullanarak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak, uzun ve ince ucu (Şekil 2) ile bir kanül oluşturmak için kılcal çekin. kullanılan ayarlar şunlardır: Isı - 700, Pull - 100, Hız - 50, Zaman - 10. </li><li> Basınç myograph odasının tutucu içine kanül yerleştirin. uygun kanüller aynı hizaya getirin. </li><li> Dikkatle istenilen çapa mikroskop altında bir forseps kullanarak kanüller ipuçları bölünürler. Burada, bir 10 um ucu ile bir kanül (Şekil 2) göstermektedir. </li><li> 1.8 mM Ca2 + içeren yapay serebrospinal akışkan (CSF) her iki kanüllerin doldurmak; % 1 sığır serumu ile desteklenmiş Ca2 + içermeyen ACSF bölmeyi doldurmakalbümini (BSA) + 10 uM diltiazem (bütün çözeltiler, deney başlamadan önce taze hazırlanmalıdır). odasının boyutuna bağlı olarak, 5 ila 20 ml arasında aCSF hacmini gösterir. Kanülasyon başlatmak için hazır olana kadar 4 ᵒ C odasına saklayın. NOT: Diltiazem kanül kolaylaştıran arteriollerin genişlemesine neden olur tersine çevrilebilir bir L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum inhibitörü, </li></ol> Parankimal arteriollerin 2. izolasyonu <ol><li> Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış laboratuarda standart protokolleri kullanarak hemen önce diseksiyon hayvan Euthanize. Diğer yaygın olarak kullanılan anestezikler, serebral dolaşım 15 vazodilatör etkileri olabilir barbitüratlar veya karbon dioksit kullanılması tercih edilmektedir. Burada gösterilen tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Tıp Nevada Okulu Üniversitesi Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış, ve ag geçmiş bulunmaktadır&quot;Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yol Gösterici İlkeler&quot; Sağlık National Institutes ile reement. </li><li> Karbondioksit kullanarak hayvan Euthanize. dekapitasyon önce, hayvan nefes durdu ve pençeleri kısma zaman tepkisiz olduğunu olduğundan emin olun. </li><li> keskin bir makas (fare) ya da giyotin (sıçan) kullanarak hayvan başını kesmek. Hayvanın başının cildi çıkarın ve ince uçlu makas kullanılarak orta hat kafatası sütür boyunca kesilir. künt forseps (fare) ya da kemik Pense kullanarak dikkatli bir şekilde kafatası kemikleri kaldırmak ve beyni maruz kalmaktadır. yavaş ve dikkatli yüzey pial damarlara zarar etmeyecek şekilde beyin çıkarın. Buz üzerinde% 1 BSA ile desteklenmiş Ca2 + içermeyen aCSF 20 ml dolu bir kap içine beyin yerleştirin. </li><li> % 1 BSA ile desteklenmiş buz soğukluğunda Ca2 + içermeyen ACSF bir ped ihtiva eden bir diseksiyon çanak doldurun ve çanak (Şekil 2A) için yukarı doğru bakan ventral yüzeyi ile beyin aktarın. Bir dissec altında tabak yerleştirinting mikroskobu (Şekil 3A). 27-gauge iğne kullanılarak pad beyin sabitleyin. orta serebral arter (MCA) yakınlarındaki işaretçilerine yerleştirerek önlemek için dikkatli olun. </li><li> Willis ve ondan dallanma MCA Çemberi yerelleştirilmesine. Keskin ve hizalanmış Vannas yaylı makas kullanılarak, MCA etrafında küçük bir dikdörtgen kesin. Bu dikdörtgen MCA tüm uzunluğu boyunca genelinde 5 mm yakın olduğundan emin olun. Dikdörtgenin üst kısmı (Willis, Şekil 2B, ok Circle proksimal) Willis poligonu gelen dallanma noktasından öteye olmalıdır. </li><li> 3 mm - Vannas yaylı makas kullanılarak, yaklaşık 2 için doku derinlemesine bir alttan gerçekleştirin. NOT: Bu bölüm parankimal arteriollerin iyi izolasyonu için kritik olduğunu ve doğru almak için birkaç deneme alabilir. kesim yeterince derin yapılmış notu ise, izole parankimal arteriol kısa olacaktır; kesim çok derin ise disseke zaman, arteriol kendi dallanma noktasında kıracakdoku çıkarılır. </li><li> böcek pimleri kullanarak yukarı (Willis poligonu gelen distalinde) bakan MCA ile diseksiyon çanak içine beyin dilim en uzak ucunu aşağı pin. sığ bir kesi altta yatan serebral korteks (aksi pimleri tutmak olmaz) çok derin kesmek için dikkatli olmak, pin yakın pia kesmek için emin olun. </li><li> Dikkatle küçük forseps ile pia her tarafında yakala ve korteksten pia soyma başlar. Gerekirse, çevredeki pial zarı hasar olmadığından emin olduktan, MCA üzerinde tutmak. </li><li> MCA içeren pia korteks serbest kalıncaya kadar soyulması tutun. soyulmaya karşı direnç Çember Willis yakın artacağını unutmayın. uzun parankimal arteriyollerde bu bölgede olacak çünkü, bu noktada ekstra dikkatli olun. </li><li> Pia ücretsiz sonra, (Şekil 2B) aşağı bakacak şekilde Arteriolleri parenkimal yüzey ile ters diseksiyon çanak pedin üstüne dikkatlice yerleştirin. </li> &lt;li&gt; Vannas yaylı makas kullanarak, geminin uçları açık açık kesilir emin olun, MCA ücretsiz disseke Arteriolleri kesip. </li><li> Toplanan arteriyoller basınç myography, moleküler analiz, ya da yerli düz kas veya endotel hücrelerinin izolasyonu için de kullanılabilir. </li></ol> 3. Basınç myography <ol><li> Vaktinden önce dikiş hazırlayın. 5 mm parçalar halinde koyu yeşil naylon iplik kesin ve Petri kabı bir çift taraflı bant yapışkan tarafına yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps kullanarak filamentler içine her parçayı ayrı ve gevşek bir ucunu diğer içine filaman geçirerek basit bir yarı-hitch düğüm hazırlamak. </li><li> forseps kullanarak, çok fazla basınç ile kapmak için değil emin, çift taraflı bant kapalı bir düğüm seçin. kanül üzerine banyo çözüm, slayt düğüme dikiş çekin ve kanülün ucundan bir mesafede sıkın. Her kanül 2 sütür için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Bir cam Coat% 10 BSA çözeltisi ile mikropipet ve daha sonra% 1 BSA ile desteklenmiş Ca2 + içermeyen ACSF aşırı durulayın. </li><li> Cam mikropipet içine çözeltinin 50 ul çekin bir parankimal arteriolden yukarı çekin ve basınç myography odasına transfer. Cam mikropipet iç odaya yapışmasını önlemek için odasına parankimal arteri dağıtmak için bir sıvı hareket pistonu itin. </li><li> iki süper ince forseps kullanarak, sadece geminin çok ucunu dokunmaya özen göstererek, PA lümen açın. </li><li> forseps kullanarak dikkatli bir şekilde kanül üzerine gemi çekme, parankimal arteriyol kenarlarını tutun. Damar kanül (Şekil 3A) çok konik sonunda olmayacak şekilde kanül üzerinde yeterince çekin. </li><li> Kanül 2 sütür gevşetin ve gemi (Şekil 3B) onları sıkın. Uzay gemi üzerinde ayrı sütür biraz ve operatöre doğru çekin tigh ikenOn onu. herhangi bir dalları parankimal arteriole diğer ucunu kapatmadan önce kapalı bağlı olduğundan emin olun. </li><li> etrafında odasına dönün ve bir kör-sac olarak parankimal arteriole diğer ucunu kapatın. Bunu başarmak için, ters kanül üzerinde bağları açıp arteriole üzerine geçmektedir. Yavaş yavaş parankimal arteriol kanülün tarafına bağlı olacaktır şekilde düğüm kapatın. arteriole boyuna streç kaçının. (Şekil 3C). NOT: Bu çalışmanın amacı, lümen yoluyla ilaç perfüze edilmesi için ise, kanülün tarafına parankimal arteri bağlama yerine ucunu kanüle. kanüller herhangi bir tuz kristalleri veya intraluminal akışını engellemek iç yapı-up yok emin olun. Fizyolojik seviyelerde kesme gerilimi muhafaza etmek için uygun bir şekilde akış hızını düzenler. Shih ve ark. Tarafından yapılan bir çalışmada sıçanlarda 8 Arteriolleri delici içinde debileri gösterir ve pi için bir başlangıç ​​rehber olarak hizmet verebilirlot çalışmaları. </li><li> Dikkatle damar çapı kayıt için kullanılmak üzere mikroskop aşamasına odası aktarın. Doğru tüplere perfüzyon için sıcaklık probu ve giriş ve çıkışları bağlamak, mikroskop sahneye odasına takın. (Bir basınç transdüktörüne bağlanan, peristaltik pompa, vb. Su sütunu) laboratuarda uygun bir basınç sistemi kullanılarak, 40 mm Hg lümen içi bir fare parankimal arteriyollerin için basınç veya sıçan arteriyollerin 50 mmHg arteri zorlar. Şekil 4D bir örneğini göstermektedir bir basınç transdüktörüne bağlı peristaltik pompa kanül arteri basınç uygulamak için. </li><li> Çapı (Şekil 3E) değişiklikleri tespit etmek için kullanılan sistemi açın. Mümkün olan en iyi algılama elde etmek amacıyla, bu tür aydınlatma ve kontrast gibi mikroskop ayarları ayarlayın. İdeal arteriole duvarları karanlık ve lümen saydam olmalıdır. algılama uygun olduğunda, t kaydetmeye başlamakO deneme. </li><li> superfusion sistemini başlatın. 5 ml / dak - 3 arasında bir akış hızında 15 ila 20 dakika süreyle 1.8 mM Ca2 + içeren sıcak (37 ᵒ C) ACSF kanüllenmiş, basınçlı parankimal arteri yıkayın. Bu CSF diltiazem ve BSA içermemelidir. </li><li> hazırlık canlılığı değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF düzenli aCSF değiştirin. 60 mM KCI% 20 ​​daralma - Bu noktada PA 10 sergilemelidir. arteriole ölçüde daraltıyor vermezse, kaldırmak ve başka arteri cannulate. </li><li> Düzenli aCSF ile 60 mM KCl yıkayın. bir saat kadar sürebilir spontan miyojenik ton, üretimi kadar bekleyin. arteriole o zamana kadar miyojenik sesi yoksa, başka bir arteriyol ile değiştirin. Not: miyojenik sesi kontraktil agonistleri veya yüksek KCI çözeltisi uyarı olmaksızın kabın lümen çapına kademeli bir ve bazen yavaş azalma olarak görülmektedir. Miyojenik tonu aşağıdaki f hesaplanırormula: (1 - (aktif lümen çapından / pasif lümen çapı)) 100 5 x miyojenik sesi uygun miktarda vb tedaviler, suşlar, türler, transgenik göre değişebilir.. % 30 5 - Genel olarak, fizyolojik miyojenik ton 15 arasında değişmektedir. </li></ol> 4. Örnek Basınç myography deneyler: agonist kaynaklı Daralma andMyogenic reaktivite <ol><li> uygun konsantrasyonlarda ACSF tercih edilen bir agonistin bir seyreltme serisi hazırlanır. Bu örnek için tromboksan A2 reseptörü agonisti U46619 kullanılmıştır. 1 mM&#39;lik bir konsantrasyonda U46619 1 ml stok çözeltisi elde edilmiştir. Aktarım 100 uM U46619 ihtiva eden bir çözelti elde ilacın 10 kat seyreltme yapmak aCSF 900 ul ihtiva eden yeni bir tüpe 1 mM çözeltisinin 100 ul. Bir konsantrasyon-yanıt konstriktör eğrisi hazırlamak için 1 mM&#39;den 100 nm arasında değişen, 6 dilüsyonları için bu işlemi tekrar edin. </li><li> EkleaCSF superfusing 100 ml (daha sonraki bütün doz 900 ul ve ardından ilk doz için 1 ml) agonist içeren çözeltinin tüm hacmi. Bu agonistin ilave 100 kat seyreltildikten yol açacaktır. Bu durumda, 10 pM ila 10 uM banyosu aralığında agonist nihai konsantrasyonlar. lümen çapı kararlı duruma ulaşıncaya kadar, arteriol ~ her konsantrasyonda 10 dakika inkübe izin verin. </li><li> PA çapı özgün değerine geri gelene kadar herhangi bir ilaç vermeden aCSF PAS superfusing ile agonist yıkayın. Maksimum genişlemeyi başlatıcı ve arteriole pasif çapı kaydetmek için 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA ile desteklenmiş (BSA) olmadan Ca 2 + içermeyen aCSF parankimal arteri kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> dikkatlice ilişkilerin ucuna tutarak çekerek kanül parankim arteri çıkarın. artıkları ve agonist fazlasının ayrılması için çift deiyonize su ile damar haznesi yıkayın. Ca odasına doldurun2 + içermeyen aCSF + BSA ve başka bir arteri cannulate. Arteriol başına birden fazla deney yapılması tavsiye edilmez. </li><li> Bir miyojenik tepkime deneyi gerçekleştirmek için, kendiliğinden miyojenik tonu (yukarıda tarif edilen) oluşturulana kadar parankimal arteriol 40 mmHg lümen içi basınçta dengelenmeye gelmeye bırakın. lümen çapı kararlı duruma ulaşana kadar, 10 dakika - 5 mmHg intraluminal basıncı azaltmak ve PA ~ 5 için gelmesini sağlayınız. (20 mmHg artışlarla 5 140 mmHg örneğin) tercih aralığını kullanarak intraluminal basınç kademeli artırın. </li><li> Bu nedenle deney sonuçlarını değiştirerek, endotel çökmesine neden olabilir ve zarar verebileceğinden, 5 mmHg&#39;nin altında intraluminal basınç arteri maruz bırakmayın. </li><li> Basınç eğrisinin sonunda lowes başlayarak 10 uM Diltiazem + 2 mM EGTA ile takviye edilmiş Ca (BSA&#39;sız) 2 + içermeyen ACSF parankimal arteri superfuse ve basınç adımları tekrarlayınt basıncı. NOT: Bu formülle belirlenen% myojenik sesi hesaplanması için gerekli olan PA pasif çapları, verecektir:% tonu = (1 - (aktif çap / pasif çap)) x 100. </li></ol>

<ol>
	<li>Dunn, K. M., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+signaling+in+the+brain+and+the+pathological+consequences+of+hypertension.">Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).</li><li>Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+regulation+in+the+normal+brain+and+in+Alzheimer's+disease.">Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2,+a+postulated+astrocyte-derived+neurovascular+coupling+agent,+constricts+rather+than+dilates+parenchymal+arterioles.">Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).</li><li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex.">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).</li><li>Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+myogenic+tone+and+structure+of+parenchymal+arterioles+by+hypertension+and+the+mineralocorticoid+receptor.">Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).</li><li>Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+glucocorticoid+signaling+remodels+neurovascular+coupling+through+impairment+of+cerebrovascular+inwardly+rectifying+K++channel+function.">Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).</li><li>Dabertrand, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channelopathy-like+defect+underlies+early-stage+cerebrovascular+dysfunction+in+a+genetic+model+of+small+vessel+disease.">Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).</li><li>Cipolla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pressure-induced+tone+in+rat+parenchymal+arterioles+vs.+middle+cerebral+arteries:+role+of+ion+channels+and+calcium+sensitivity.">Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity.</a> Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).</li><li>Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+nerves+and+the+regulation+of+cerebrovascular+tone.">Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone.</a> Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).</li><li>Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+receptors+regulate+myogenic+tone+in+cerebral+parenchymal+arterioles.">Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors,+calcium+signaling,+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation.">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation. 20, 307-316 (2013).</li><li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+dilates+brain+parenchymal+arterioles+by+conversion+of+calcium+waves+to+sparks+to+activate+BK+channels.">Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels.</a> Circ Res. 110, 285-294 (2012).</li><li>You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+endothelial+P2+purinoceptors+in+the+cerebrovascular+tree+of+the+rat.">Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat.</a> Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).</li><li>Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+isoflurane-+and+sevoflurane-induced+cerebral+vasodilation+in+rabbits.">Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).</li><li>Fisher, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arterial+lesions+underlying+lacunes.">The arterial lesions underlying lacunes.</a> Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).</li><li>Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+changes+in+the+white+mater+in+dementia.">Microvascular changes in the white mater in dementia.</a> J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).</li><li>Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+hypertension+on+the+cerebral+circulation.">The effects of hypertension on the cerebral circulation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).</li><li>Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+cortical+astrocytes+and+arterioles+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling.</a> Circ Res. 95, e73-e81 (2004).</li><li>Dacey, R. G., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+rat+intracerebral+arterioles:+methods,+morphology,+and+reactivity.">A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity.</a> Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).</li><li>Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+isolation+and+characterization+of+intracerebral+arterioles+in+the+C57/BL6+wild-type+mouse.">Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse.</a> J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).</li><li>Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKCa+and+IKCa+Channels,+myogenic+tone,+and+vasodilator+responses+in+middle+cerebral+arteries+and+parenchymal+arterioles:+effect+of+ischemia+and+reperfusion.">SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion.</a> Stroke. 40, 1451-1457 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Serebral parankimal arteriyollerde farklı nöron popülasyonları serpmek birkaç anastomoz ve şubeleri ile yüksek direnç arteriyollerinde vardır. Bu özel kan damarları astrosit aracılı vazodilatasyon 1 ile serebrovasküler otoregülasyonun ve nörovasküler kaplin merkezi oyuncular. Serebral vasküler hastalık bu özel kan damarlarının önemi Doktor Miller Fisher öncü çalışması hipertansif hastalarda ölüm sonrası 16 beyinlerinde laküner infarkt topraklarında paranki...

serebral dolaşım benzersiz merkezi nöronları, enerji depolar sınırlı ve oksijen basıncı ve gerekli besinlerin temini değişimlere dolayısıyla son derece duyarlıdır hücrelerin metabolik taleplerini desteklemek üzere düzenlenmiştir. Özel görevler yapılırken özellikle nöronal alt popülasyonlar aktif hale geldikçe, damarsal yerel hipoksi ve besin 1 tükenmesi önlemek için perfüzyon oldukça lokalize bir artış teşvik etmektedir. Bu aktif nöronlar, astrositler ve serebral arterlerin 2 oluşan nörovasküler kaplin olarak bilinen fonksiyonel hiperemi şeklidir ve nörovasküler ünitenin düzgün çalışması bağlıdır. İntraserebral parankimal Arterioller, kan damarları, parankimal kapsayan delici ve pre-kapiller arteriol bir grup, bu yanıt için merkezi önem taşımaktadır ve nörovasküler kaplin 3 araştırmak amacıyla bunları tek tek incelemek için kritik öneme sahiptir. &lt;beyin içinde farklı nöron popülasyonları serpmek - (70 mikron iç çapı 20) yüksek dirençli kan damarları p class = &quot;jove_content&quot;&gt; parankim arteriol küçüktür. Yüzeyde pial arterlerden dallanma, parankimal arteriol yeraltı mikro dolaşımı (Şekil 1) beslemek için yaklaşık 90 ᵒ açıyla beyin parankimi içine nüfuz eder. Bu arteriyollerde onlar kılcal koruyan en uzak düz kas içeren kaplar gibi uygun perfüzyon basıncını muhafaza kritik bir rol oynamaktadır. Yüzey pial dolaşıma aksine, parankimal arteriol teminat şubesi ve anastomoz eksikliği ve dolayısıyla serebral dolaşımın 4 &quot;darboğazlar&quot; dir. Sonuç olarak, parankimal arteriollerin disfonksiyonu gibi vasküler kognitif bozukluk ve küçük iskemik inme (aynı zamanda sessiz veya laküner vuruş olarak da bilinir) gibi serebrovasküler hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. çalışmalar Indicate bu parankimal arteriyollerinde disfonksiyonu esansiyel hipertansiyon 5, kronik stres 6 tarafından uyarılan ve küçük damar hastalığı, genetik fare modelinde 7 erken bir olaydır olabilir. Sıçanlarda bir nüfuz arteriyollerin Bundan başka, deneysel olarak indüklenmiş oklüzyon yaşlı insanlarda 8 gözlenenler silindirik, benzer küçük bir iskemik inme neden olmak için yeterli olduğunu. Bu anatomik farklılıklara ek olarak, kontraktil fonksiyon düzenleyici mekanizmalar Pial arter ve parenkimal arteriyollerin arasında farklılık gösterir. Miyojenik vazokonstriksiyon nedeniyle muhtemelen damar düz kas hücrelerinde 12,13 sinyalizasyon hücre içi Ca dışsal inervasyon 10, mechanotransduction 11 farklı modları ve farklılıkların olmaması 2+ arasında parankimal arteriyollerde 9 daha fazladır. Kanıt endotele bağımlı vazodilatör mekanizmaları da bu vascu arasında farklılık göstermektedirCa 2+ içeren mekanizmalar üzerinde daha fazla güven sergileyen parankimal arterler ile lar bölümleri, nitrik oksit ve prostasiklinler 14 olarak yayılabilir faktörlerle karşılaştırıldığında damar duvarındaki K + kanalları ve elektrotonik iletişim -etkinleştirilmiş. Bu nedenle, veri serebral perfüzyon yerel kontrolü bilgimizin bir boşluk bırakarak, mutlaka Arteriolleri parenkimal için geçerli olmayabilir pial arterleri kullanarak deneylerde toplandı. Onların önemine rağmen, parankimal arteriol öncelikle izolasyon ve ex vivo çalışma için montaj teknik zorluklar altında incelenmiş, büyük ölçüde vardır. Bu yazıda izole ve basınç myography için kullanılabilir ya da immunolabeling, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, ve biyokimyasal analiz için doku izole etmek için olan serebral parenkimal arteriyollerin kanülasyonu için bir yöntem tarif eder.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Artificial Cerebrospinal Fluid&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Isolation/Cannulation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &amp;mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles

parankimal Arteriolleri, delici arteriol ve pre-kapiller Arteriolleri içeren Intraserebral parankimal arteriol (genelge), beyin parankimi içine pial arterler ve arteriol ve dalış dallanma yüksek direnç kan damarları vardır. Bireysel PA parankim ayrı bir silindirik bölge ve içinde bulunan nöronlar serpmek. Bu arteriyollerde yerel serebral kan akımı, hem küresel (serebrovasküler otoregülasyon) ve (fonksiyonel hiperemi) düzenlenmesinde merkezi bir oyuncu vardır. PA nörovasküler biriminde, beyin içinde metabolik aktivite bölgesel kan akımı ile eşleşen bir yapının parçası olan ve aynı zamanda nöronlar, internöronlardan ve astrositler içerir. Pleomorfik adenomun ile perfüzyon doğrudan yem PA genişlemesinden kaynaklanır yerel perfüzyon bir artışlarına söz konusu bölgede nöronlar ve nöronal metabolizma kurşun artışların aktivitesi ile bağlantılıdır. Pleomorfik düzenlenmesi daha iyi karakterize farklıdırpial arterler. Basınç kaynaklı vazokonstriksiyon PA olgularında daha büyüktür ve vazodilatör mekanizmaları değişir. Buna ek olarak, PA perivasküler sinirler dışsal innervasyon almıyorsunuz - innervasyon astrositik endfeet ile temas yoluyla içsel ve doğada dolaylı olduğunu. Böylece, pial arterleri kullanarak çalışmalarla biriken kontraktil düzenlenmesi ile ilgili verileri doğrudan PA işlevini anlamak için anlamına gelmez. Hipertansiyon ve diyabet gibi patolojik durumlar, PA yapısı ve reaktivite nasıl etkilediğini Ayrıca, belirsiz kalır. Bu bilgi boşluğu kısmen PA izolasyon ve kanülasyona ilişkin teknik zorluklar bir sonucudur. Bu yazıda izolasyon ve kemirgen PA olgularının kanülasyon için bir protokol mevcut. Dahası, agonist kaynaklı daralma içi ve kas reaktivitesi de dahil olmak üzere, bu arteriyoller ile yapılabilir deneylerin örnekleri göstermektedir. Bu yazının odak noktası PA kanülasyon ve basınç myography üzerinde olmasına rağmen, PA izoles da biyokimyasal biyofiziksel moleküler ve görüntüleme çalışmaları için kullanılabilir.

Şekil 5A hazırlık bütünlüğünü değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF fare PA olgularının temsili daralmasını gösterir. 60 mM KCI mevcudiyetinde% 30 - PA 15 arasında büzülür gerekir. daralma% 15 altında ise, PA atmak ve arteriole izolasyon ve kanülasyon sırasında zarar gördüğünü anlaşılacağı gibi, başka bir cannulate. Şekil 5B, superfusing banyosuna tromboksan A <...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles at JoVE.com

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Görüntüleme.  University of Nevada School of Medicine. This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Video: Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Kalıcı Serebral Gemi Tıkanıklığı<em&gt; Ile</em&gt; Çift Ligature ve transeksiyonu

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Tıp

Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs must be tailored specifically to the lesion, with surgical resection being the gold standard for small, accessible lesions. Pre-operative embolization of AVMs can reduce nidal blood flow and remove high-risk AVM features such as intranidal or venous aneurysms, thereby simplifying a challenging neurosurgical procedure. Herein, we describe our approach for the staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and highlight the advantages of having a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team. This includes planning the craniotomy and resection to immediately follow the final embolization stage, thereby using a single session of anesthesia for aggressive embolization, and rapid resection. Finally, we provide a representative case of a 22-year-old female with an unruptured right frontal AVM diagnosed during a seizure workup, who was successfully treated via staged embolizations followed by open surgical resection.

Surgery is the gold standard for accessible arteriovenious malformations (AVMs), and pre-operative embolization can simplify this procedure. We describe our approach for staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and provide a representative clinical example highlighting the advantages of a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team.

Kapsamlı Endovasküler ve serebral Arteriovenöz malformasyonlar açık cerrahi yönetimi

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs ...

Nörobilim

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Fonksiyonel Çalışma için Ex Vivo Basınçlı Hipokampal Kapiller-Parenkimal Arteriyol Hazırlığı

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biyoloji

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three decades, its standardization remains inadequate. Predominantly conducted on rats and mice, the procedure poses challenges due to mice's smaller and more fragile nature. Unlike the Koizumi common carotid artery method, the Longa external carotid artery is the sole intraluminal filament stroke model ensuring complete reperfusion post-ischemia. This aspect holds critical significance for studies investigating reperfusion phenomena. The surgical modifications demonstrated in this article ensure continuous blood flow from the common carotid artery throughout the ischemic phase and after the reperfusion onset. The goal of these modifications is to selectively occlude the middle cerebral artery by keeping the perfusion uninterrupted in branches proximal to the middle cerebral artery during the ischemia period. Furthermore, the onset of reperfusion is sudden and can be precisely controlled, thereby modeling endovascular thrombectomy in human medicine more accurately. Our aim in presenting this comprehensive video article is to ease the training of new surgeons and promote the standardization of surgical procedures within the scientific community.

This protocol presents a step-by-step guide for researchers to perform the middle cerebral artery occlusion procedure on mice using the modified Longa external carotid artery method. Modifications presented in this article aim to increase the accuracy of middle cerebral artery occlusion and ensure complete reperfusion.

Longa Orta Serebral Arter Oklüzyon Yönteminin Tam Reperfüzyon için Optimizasyonu

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Hakim, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63463">Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Fare Parankimal Arteriyollerinden Serebral Endotel Tüplerinin Hazırlanması

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1.&#160;Solutions and drugs

	...