Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Ringraziamo e riconoscere Dr. Peter Nelson e Sonya Anderson presso la banca del tessuto di cervello UK-ADC per la fornitura di cervello umano tutti i campioni di tessuto (NIH concedere numero: P30 AG028383 dal National Institute on Aging). Ringraziamo Matt Hazzard e Tom Dolan, servizi di Information Technology, tecnologia accademico e impegno di facoltà, Università del Kentucky per assistenza grafica. Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione numero 1R01NS079507 dall'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (a B.B.) e dalla concessione numero 1R01AG039621 dall'Istituto nazionale su invecchiamento (per A.M.S.H.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dell'Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo o l'Istituto nazionale su invecchiamento. Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Le informazioni di seguito si basano su sicurezza attuale e gli standard normativi presso l'Università del Kentucky, Lexington, KY, Stati Uniti d'America. Come precauzione di sicurezza, consultare programma sicurezza biologica dell'istituzione e delle più attuali normative e raccomandazioni prima di lavorare con tessuti umani.
Attenzione: Il tessuto umano può essere una fonte di sangue agenti patogeni, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), virus dell'epatite C (HCV) e altri. Lavoro con tessuto umano comporta il rischio di infezione da patogeni presenti nel sangue. Di conseguenza, alcune considerazioni di sicurezza e normativi sono indispensabili quando si lavora con tessuti umani per proteggere il personale di laboratorio. Lavorare con tessuto umano negli Stati Uniti richiede un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, nonché precauzioni di sicurezza e formazione secondo NIH sezione IV-B-7, OSHA Act del 1970 clausola 5(a)(1) e programma istituzionale sicurezza biologica dell'utente. In generale, approvazione Comitato istituzionale biosicurezza e/o Institutional Review Board deve essere ottenuto prima di svolgere qualsiasi ricerca che coinvolge umani materiali (tessuti, fluidi corporei). La formazione è necessaria per tutti coloro che lavorano con materiali umani e include training di sicurezza di laboratorio di base, ad es., chimica igiene e sicurezza del laboratorio, nonché formazione specifica sulla sicurezza biologica, rifiuti pericolosi e umani patogeni presenti nel sangue. Tutti coloro che lavorano con materiali umani è altamente raccomandati per ottenere le vaccinazioni di epatite B, prima di lavorare con materiali umani. Personale sono tenuto a indossare specifici dispositivi di protezione individuale durante il lavoro con materiali umani, ad es., un camice da laboratorio con risvolto e una faccia scudo e indossare i guanti in ogni momento. Tutto il lavoro viene eseguito in una cappa di biosicurezza (classe 2). Tutte le apparecchiature che viene in contatto con materiali di umani e ogni rifiuti da materiali umani viene gestita in modo appropriato per evitare contaminazione e/o infezione del personale. Tutte le attrezzature e le superfici vengono pulite con etanolo al 10% candeggina e il 75% dopo ogni procedura che coinvolga materiali umani. Una fuoriuscita con materiali umani dovrà essere immediatamente pulita. La cristalleria è sterilizzato nell'autoclave dopo ogni utilizzo. Rifiuti, compreso il tessuto umano non fissato, sono raccolti in un sacchetto di rifiuti con etichetta biohazard e sterilizzati in autoclave. Sharps sono raccolti in un contenitore di puntura e antiperdita etichettato come biologici pericoloso. Tutti i rifiuti da materiali umani sono stato eliminato secondo norme di sicurezza biologica dell'istituzione.
Nota: Il nostro laboratorio ottiene i campioni freschi corteccia frontale da individui deceduti attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M). Criteri di inclusione sono: registrazione in studio del gruppo di analisi longitudinale UK-ADC e un intervallo Post-Mortem (PMI) ≤ 4 h64. Autopsie seguono un protocollo standard e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Un breve PMI di meno di 4 ore è di massima importanza per garantire redditività capillare dopo l'isolamento. Possono essere utilizzati tessuti sia freschi che congelati. Se il congelamento è necessario, tessuto cerebrale umano appena ottenuti dovrebbe essere scossa-congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C. Tessuto fresco o scongelato dovrebbe essere memorizzato nel buffer di isolamento (Vedi sotto) ed elaborato rapidamente. Troviamo che 10 g di tessuto umano fresco rendimenti circa 100 mg di capillari cerebrali (peso umido).
1. installazione
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Preparazione del tampone Nota: Il volume di tampone necessario dipende dalla quantità di tessuto. Tutti i volumi di buffer nel protocollo seguente sono basati su 10 g di tessuto di corteccia del cervello umano.<ol>
<li>L isolamento Buffer: Utilizzare 1,5 L di soluzione tampone fosfato e di Dulbecco (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) e completare con 5 mM D-glucosio (1,35 g ) e 1 mM sodio piruvato (0,165 g). Dopo l'aggiunta del glucosio e del piruvato, regolare a pH 7.4 con idrossido di sodio. Raffreddare e conservare il buffer a 4 ° C prima dell'uso.</li>
		<li>Albumina di siero bovino (BSA): Aggiungere 10 g di polvere di BSA a 1 L di tampone di isolamento a una concentrazione finale di BSA 1%. Mescolare lentamente per evitare bolle, regolare a pH 7.4 e conservare a 4 ° C durante la notte. Immediatamente prima dell'uso, mescolare delicatamente; evitare la formazione di bollicine per evitare la denaturazione di albumina.</li>
		<li>medio di gradienti di densità: pesare 18 g di medio gradiente di densità in una bottiglia di vetro e aggiungere un ancoretta magnetica. Aggiungere 60 mL di buffer di isolamento e agitare vigorosamente per 5 minuti fino a quando tutti i polvere viene sospesa. Archivio durante la notte a 4 ° C per consentire allo densità gradiente a sciogliere. Mescolare per 10 min destra prima dell'uso.</li>
		<li>Memorizzare tutti i buffer a 4 ° C; mantenere tutti gli strumenti e buffer sul ghiaccio durante la procedura di isolamento intero. Mescolare tutti i buffer prima dell'uso.</li>
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Messa a punto sperimentale
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<li>Montare il pestello del macinino Potter-Chazen tessuto sull'agitatore elettronico. Posto il Potter-Chazen tessuto smerigliatrice e l'omogeneizzatore lisata con pestello su ghiaccio sotto il cofano. Preparare una maglia del filtro 300 µm (5 x 5 cm2), piegarlo ad un cono e inserire e allegarlo a un 50 mL tubo Falcon con nastro (Figura 1A).</li>
		<li>Inserire anelli di collegamento e filtri di ceppo di cella (dimensione dei pori: 30 µm) su provette Falcon da 50 mL. Preparare sacchetti di rifiuti a rischio biologico. Collocare tutte le necessarie attrezzature nella biosicurezza armadio (Vedi Tabella materiali).</li>
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</ol>2. preparazione del campione cervello
Nota: La Figura 1A Mostra il diagramma di flusso di lavoro della procedura intero isolamento descritta di seguito. Tessuto di cervello umano può provenire da qualsiasi parte della corteccia e può essere utilizzato fresco o congelato. Tessuto cerebrale congelati possa essere scongelato a temperatura ambiente (nessun buffer; ~ 30 min per 10 g). Per ottenere risultati comparabili, il tessuto cerebrale dovrebbe essere ottenuto dalla stessa regione del cervello per ogni esperimento. Questo protocollo è ottimizzato per fresh (PMI < 4h) corteccia cerebrale umana che non è stato congelato.
<ol><li>Preparazione del tessuto di cervello umano: documentare il peso del tessuto cerebrale. Tutti i numeri nel seguente protocollo sono adatti per 10 g di tessuto cerebrale umano fresco. Posizionare il tessuto cerebrale in un 100mm di Petri. Rimuovere con cura tutte le meningi con il forcipe. Utilizzare un bisturi per tagliare la materia bianca.</li>
	<li>Macinazione del tessuto cerebrale umano: attentamente tagliare il tessuto cerebrale e usa mezzi con un bisturi. Tritare per circa 5 min (2 – 3 mm pezzi). Trasferire il tessuto cerebrale per la smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen. Aggiungere 30 mL di buffer di isolamento. Nota: I pezzi di tessuto macinate sono difficili da vedere dato che il tessuto cerebrale si trasforma in poltiglia attraverso il processo di macinazione.</li>
</ol>3. omogeneizzazione
<ol><li>Smerigliatrice di tessuto Potter-Chazen (clearance: 150 – 230 µm): omogeneizzare ogni campione con 100 colpi ad una velocità di omogeneizzatore di 50 giri/min. Documentare il tempo ogni 25 colpi e il tempo totale necessario per 100 colpi. Vedere la tabella 1 per un protocollo di omogeneizzazione proposto; il tempo totale per l'omogeneizzazione di 10 g di corteccia frontale umana è circa 22 min. Non si mescoli in aria per evitare bolle.</li>
	<li>Lisata omogeneizzatore (clearance: 80 – 130 µm): trasferire l'omogeneizzato in un omogeneizzatore lisata sul ghiaccio. Omogeneizzare la sospensione con 20 colpi (~ 6 s/corsa, totale di ~ 2 min). Evitare le bolle.</li>
</ol>4. centrifugazione
<ol><li>Distribuire equamente omogeneato del cervello in quattro provette da 50 mL centrifugazione e il volume totale dell'omogeneato del documento. Distribuire 50 mL di tampone di gradienti di densità nelle provette centrifugazione (12,5 mL per tubo). Utilizzare 10 mL di buffer di isolamento per sciacquare il pestello e omogeneizzatore e dividere i quattro tubi di centrifugazione (~2.5 mL per tubo).</li>
	<li>Chiudere bene le provette per centrifuga con tappi. Mescolare l'omogeneato, densità gradiente medio e buffer agitando vigorosamente i tubi. Centrifugare a 5.800 x g per 15 min a 4 ° C (rotore ad angolo fisso); Selezionare una velocità di decelerazione media di mantenere il pellet fissato al tubo. Scartare il surnatante e risospendere in 2 mL di BSA 1% ciascuna.</li>
</ol>5. filtrazione
Nota: Per separare i capillari da globuli rossi e altri detriti cellulari, sono necessari diversi passaggi di filtrazione.
<ol><li>maglia di 300 µm: dopo la ri-sospensione il pellet, filtrare la sospensione attraverso la maglia di 300 µm. Capillari vengono filtrati attraverso la rete, considerando che le navi più grandi e più grande cervello detriti rimangono sulla mesh. Lavare accuratamente la mesh con fino a 50 mL di BSA 1%. Scartare la mesh. Nota: Questo passaggio di filtrazione Cancella la sospensione capillare da qualsiasi più grandi vasi o porzioni di detriti di cervello.</li>
	<li>
Filtro di ceppo di celle 30 µM Nota: Questo passaggio di filtrazione separa capillari da globuli rossi e altri detriti di cervello.<ol>
<li>Distribuire il capillare filtrato da 6.1 scavalcare i filtri di ceppo di cella cinque 30 µm (circa 10 mL di filtrato capillare al filtro di ceppo di celle). I capillari sono ostacolati da questo filtro, considerando che globuli rossi, altre singole cellule e detriti piccolo cervello passano attraverso il filtro e vengono raccolti nel filtrato.</li>
		<li>Lavare ogni filtro con 25 mL di BSA 1%. In seguito, versare filtrati tutti sopra il sesto filtro per aumentare il rendimento. Lavare ogni filtro con 50 mL di BSA 1%; mantenere la cella ceppo filtri con contenente i capillari e scartare il filtrato.</li>
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</li>
</ol>6. prelievo
<ol><li>Capovolgere i filtri e lavare i capillari di BSA 1% per ogni filtro 50 ml in provette da 50 mL. Applicare pressione con la punta della pipetta un pipettatore 5ml delicatamente e spostarlo attraverso il filtro per lavare via i capillari del cervello.</li>
	<li>Assicurarsi di lavare tutti i capillari cerebrali, soprattutto dal bordo del filtro. Evitare le bolle poiché questo rende più difficile il processo di filtrazione e aumenta la probabilità di perdita capillare.</li>
</ol>7. lavaggio
<ol><li>Dopo aver raccolto i capillari, centrifugare tutti i campioni a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C (rotore oscillante). Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in circa 3 mL di buffer di isolamento. Combinare tutti i pellet sedimento da un campione in una provetta conica da 15 mL e riempirlo con buffer di isolamento. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 3 min a 4 ° C e lavare due volte.</li>
	<li>Documentare la purezza capillare con un microscopio (ingrandimento 100 X) e la macchina fotografica (Figura 1B). Nota: La resa capillare del cervello da 10 g di tessuto cerebrale umano è in genere circa 100 mg. I capillari del cervello isolato possono ora essere utilizzati per esperimenti, elaborati (ad es., lisato, isolamento di membrana), o essere flash-congelati e conservati a-80 ° C in provette per criogenia per un minimo di 6 – 12 mesi (evitare più cicli di gelo-disgelo).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il presente protocollo descrive l'isolamento dei capillari del cervello umano intatta e vitale dal tessuto fresco. In questa sezione discutiamo dettagliatamente quanto segue: 1) modifiche al protocollo, 2) risoluzione dei problemi di errori comuni, 3) le limitazioni della tecnica, 4) il significato del modello rispetto alle esistenti e modelli alternativi barriera emato - encefalica, e 5). potenziali applicazioni per i capillari del cervello umano isolato.
Il protocollo descritto qui è ottimi...

La barriera emato - encefalica è un'interfaccia strettamente controllata tra il sangue e il cervello che determina ciò che entra ed esce dal cervello. Anatomicamente, cellule endoteliali compongono la barriera emato - encefalica e forma una complessa, continua rete capillare. Fisiologicamente, questa rete capillare fornisce il cervello con l'ossigeno e le sostanze nutrienti mentre contemporaneamente smaltimento dell'anidride carbonica e le scorie metaboliche. Cosa importante, la prova sostiene che le modifiche alla barriera contribuiscano a numerose patologie, tra cui il morbo di Alzheimer, epilessia e ictus1,2,3,4,5 , 6 , 7. cervello cellule endoteliali anche servono come una barriera al trattamento bloccando l'assorbimento del farmaco nel cervello, ad es., chemioterapia del multiforme di glioblastoma seguito tumore resezione8,9, 10. A questo proposito, i capillari del cervello umano isolato rappresentano un unico ex vivo barriera emato - encefalica modello che ricorda da vicino barriera proprietà in vivo, che consente lo studio della funzione della barriera e della disfunzione in salute e la malattia. In questo articolo, forniamo un protocollo per isolare i capillari del cervello dal cervello umano a una qualità costantemente elevata capillare e resa per studiare la barriera emato - encefalica.
Nel 1969, Siakotos et al. 11 sono stati i primi a segnalare l'isolamento dei capillari del cervello dal tessuto di cervello bovino e umano usando densità gradiente centrifugazione e vetro perlina colonna di separazione. Più tardi, Goldstein et al. 12 migliorato questo metodo aggiungendo più passaggi di filtrazione per diminuire la quantità di tessuto necessaria per studiare i capillari cerebrali isolati dai ratti, pur mantenendo l'attività metabolica di trasporto del glucosio. Da allora, i ricercatori hanno ottimizzato la procedura di isolamento capillare numerose volte, miglioramento del metodo e cervello modello capillare con ciascuna iterazione13,14,15. Ad esempio, atomo et al. 16 isolato bovina capillari tramite digestione enzimatica piuttosto che omogeneizzazione meccanica e quindi successivamente passata una sospensione capillare attraverso un filtro a rete 210 µm e una colonna di perlina di vetro. Queste modifiche migliorato la macchia di esclusione del trypan blu dei capillari cerebrali isolato e quindi, aumentato di attuabilità delle cellule endoteliali. Nel 1990, Dallaire et al. 17 isolato capillari bovini e ratto che erano chiare di un neurone contaminazione e mantenuto l'attività metabolica di γ-glutamil transpeptidasi (γ-GTase) e della fosfatasi alcalina. Nel 2000, Miller et al. 18, usato isolati del ratto e capillari cerebrali suina in combinazione con microscopia confocale per mostrare l'accumulo dei substrati di trasporto nel lumen dei vasi capillari. Successivamente, il nostro laboratorio ha continuato ad ottimizzare la procedura di isolamento capillare del cervello e abbiamo stabilito i saggi di trasporto per determinare la P-glicoproteina (P-gp)19,20,21, cancro al seno resistenza della proteina (BCRP)22,23e multi-farmaco resistenza proteina 2 (Mrp2) attività di trasporto di24 . Nel 2004, abbiamo pubblicato due relazioni dove abbiamo usato capillari cerebrali isolati del ratto per studiare varie vie di segnalazione. A Hartz et al. 21, abbiamo trovato che il peptide endotelina-1 rapidamente e reversibilmente ridotta funzione di trasporto P-gp in capillari cerebrali agendo attraverso del recettore dell'endotelina recettori B (ETB), l'ossido nitrico sintasi (NOS) e protein chinasi C (PKC). In Bauer et al. 19, abbiamo dimostrato l'espressione del recettore recettore nucleare pregnane X (PXR) e ha mostrato PXR-modulazione della funzione di espressione e di trasporto P-gp nei capillari del cervello. Negli esperimenti con i topi transgenici di PXR umanizzati, abbiamo ampliato questa linea di ricerca e ha dimostrato in vivo di serraggio della barriera di upregulating P-gp attraverso l'attivazione di hPXR25. Nel 2010, Hartz et al. 26 utilizzato questo approccio per ripristinare l'espressione della proteina P-gp e attività nei topi di proteina (hAPP) precursore dell'amiloide umana transgenici che sovraesprimono hAPP di trasporto. Inoltre, ripristino di P-gp in hAPP topi significativamente riducono di beta amiloide (Aβ)40e livelli del cervello Aβ42.
Oltre a studiare le vie di segnalazione, capillari cerebrali isolato possono essere utilizzati per determinare cambiamenti nella permeabilità capillare che ci riferiamo come perdita capillare. In particolare, l'analisi di perdita Texas Red è usata per valutare la perdita della tintura fluorescente Texas Red dal lume capillare nel tempo e questi dati vengono quindi utilizzati per analizzare i tassi di perdita. Tassi di perdita capillare aumentato rispetto a quelli da capillari di controllo indicano cambiamenti nell'integrità fisica della barriera emato - encefalica2. Questo è prezioso perché ci sono numerosi Stati di malattia connessi con rottura della barriera, ad es., epilessia, sclerosi multipla, morbo di Alzheimer e cerebrali traumatiche lesioni27,28,29, 30. Altri gruppi hanno anche utilizzato isolati capillari per discernere le vie di segnalazione che regolano l'espressione della proteina e l'attività di trasporto delle proteine31,32,33,34, 35,36,37. Infine, abbiamo continuato ad ottimizzare questo metodo per l'isolamento dei capillari del cervello umano e, recentemente, abbiamo mostrato l'espressione aumentata di P-gp umana barriera emato - encefalica nei pazienti con epilessia rispetto a individui di controllo di grippaggio-libero38 . Presi insieme, questi sviluppi dimostrano che i capillari cerebrali isolato possono servire come un modello versatile per studiare la funzione della barriera.
Vari in vivo, ex vivoe in vitro di barriera emato - encefalica modelli sono stati utilizzati nella ricerca di base e lo screening di stupefacenti industriali, principalmente con l'obiettivo della prova di consegna della droga per il cervello39,40,41 ,42,43,44. Oltre alle isolato ex vivo capillari cerebrali, attuale barriera emato - encefalica modelli includono modelli in silico , in vitro di colture cellulari di cellule endoteliali dei capillari del cervello isolato o linee cellulari immortalizzate da vari specie, coltura in vitro di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) che si differenziano in cellule endoteliali dei capillari del cervello e modelli di microfluidica su un chip.
In silico modelli sono più comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci per la selezione di candidati farmaci basati sul predetto assorbimento, distribuzione, metabolismo e l'escrezione (ADME) proprietà. Metodi quali modelli di relazione (QSPR) quantitative struttura-proprietà e modelli di relazione (QSAR) quantitativa struttura-attività sono metodi comuni utilizzati in high throughput screening di librerie prevedere cervello penetrazione di candidati farmaci 45 , 46. questi modelli sono utili per molecole di schermo per le proprietà di penetrazione della barriera.
Betz et al. 47 monostrati di cellule endoteliali dei capillari cerebrali coltivate, ricavandone un sistema modello in vitro della barriera emato - encefalica. In vitro modelli della coltura cellulare utilizzando tessuto fresco o linee cellulari endoteliali immortalizzate come le cellule endoteliali del microvessel cerebrale umana (hCMECs) possono essere un altro strumento di screening ad alta resa per la penetrazione di cervello o studi meccanicistici. Tuttavia, modelli di cultura delle cellule endoteliali capillari del cervello mancano la sollecitazione di taglio fisiologica del flusso sanguigno all'interno del lume capillare, sono limitate nella complessità nel complesso biologico e subiscono cambiamenti nell'espressione e localizzazione dei componenti importante barriera come le proteine di giunzione stretta, ioni, trasportatori, enzimi e recettori di superficie canali48,49,50. Al contrario, monostrati endoteliali derivati da hPSCs, hanno saccarosio bassa permeabilità rispetto alle culture hCMEC/D3 e contengono espressione polarizzata di alcuni trasportatori di barriera emato - encefalica, molecole di adesione e giunzioni strette51, 52. Tuttavia, queste cellule sono anche soggetti a modifica proprietà nella cultura, e il sistema deve essere validato per la ricapitolazione di in vivo proprietà barriera52.
Le tendenze più recenti nella barriera emato - encefalica ricerca includono utilizzando sistemi di coltura del tessuto 3D per creare capillari artificiali, utilizzando la tecnologia di organo-on-chip per generare dispositivi microfluidici, o che utilizzano la tecnologia a fibra cava53, 54 , 55. capillari artificiali, tuttavia, sono significativamente più grandi diametri (100 – 200 µm) di capillari cerebrali (3 – 7 µm). Quindi, il taglio forze in vitro non completamente simile la situazione in vivo . Questo viene affrontato in dispositivi microfluidici "blood-brain-barrier-on-a-chip", dove compartimenti di "sangue" e "cervello" di forma membrane artificiali e fluidi vengono pompati attraverso questi dispositivi che generano forze di taglio di microfluidica. Allo stesso modo, co-colture di cellule endoteliali in varie combinazioni con gli astrociti e cellule muscolari lisce vascolari sono stati anche utilizzate con la tecnologia a fibra cava per ricreare i parametri reologici presenti sotto nel vivo condizioni56 , 57 , 58. Tuttavia, non è chiaro quanto bene questo modello riflette altre proprietà della barriera sangue - cervello come trasporto, metabolismo, segnalazione e altri. Questi modelli artificiali capillare e chip sono adatti per high throughput screening di farmaci, ma le cellule utilizzate per generare questi modelli sono anche soggetti a modifiche durante la coltura.
Fette del cervello congelato e fisso o colture di cellule endoteliali capillari sono ulteriori modelli che possono essere utilizzato perlo studio del microcircolo umano5,59,60,61primario del cervello. Ad esempio, immunoistochimica del tessuto cerebrale fisso viene utilizzato per determinare la localizzazione della proteina, e l'espressione in sano rispetto al tessuto malato.
Oltre alle fettine di tessuto e i modelli in vitro capillari cerebrali di cui sopra, appena isolate possono essere utilizzati per studiare la funzione di barriera emato - encefalica. Limitazioni di questo modello capillare isolato includono la difficoltà per ottenere il tessuto cerebrale umano fresco, assenza di astrociti e neuroni e un processo relativamente lungo isolamento. Un vantaggio del modello capillare del cervello isolato è che questo modello ricorda da vicino la situazione in vivo e, pertanto, può essere utilizzato per caratterizzare la disfunzione e la funzione di barriera. Importante, può anche essere utilizzato per discernere i meccanismi di segnalazione utilizzando una moltitudine di saggi e tecniche molecolari3,19,62,63.
Il nostro laboratorio ha accesso a sia il tessuto fresco e congelato del cervello umano attraverso il centro di Sanders-Brown su invecchiamento (IRB #B15-2602-M)64. In questo contesto, le autopsie seguono un protocollo standard, cervelli sono ottenuti < 4h e tutte le procedure sono conformi alle linee guida NIH Biospecimen Best Practice65. Dato questo unico accesso al tessuto cerebrale umano, abbiamo stabilito e ottimizzato un protocollo per isolare i capillari del cervello dal tessuto di cervello umano che si traduce in un alto rendimento dei capillari del cervello umano intatto, praticabile. Due endpoint comune di interesse sono per determinare l'espressione della proteina e l'attività. A questo proposito, noi ed altri abbiamo stabilito vari saggi che possono essere utilizzati con capillari cerebrali isolato per studiare l'espressione della proteina e livelli di attività. Questi test includono Western blotting, analisi di Western semplice, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA), reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), zimografia, analisi di attività di trasporto, e saggi di perdita capillare. Queste analisi permettono ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella funzione della barriera in condizioni patologiche umane, determinare le vie che regolano l'attività e l'espressione della proteina e identificare bersagli farmacologici per il trattamento della barriera emato - encefalica associata malattie.
Presi insieme, appena capillari cerebrali isolato possono servire come un modello affidabile e riproducibile della barriera sangue - cervello. In particolare, questo modello può essere abbinato molti diversi saggi per determinare una vasta gamma di endpoint per studiare la funzione di barriera.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Personal Protective Equipment (PPE)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Disposable Protective Labcoats</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td></tr><tr><td>Face Shield, disposable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>19460102</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td></tr><tr><td>Safety Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Paper 18&quot; x 20&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>to cover working areas</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>for used scalpels</td></tr><tr><td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.</td><td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C Refrigerator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscope</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td><td></td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td><td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>used to freeze the tissue?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analytical Balance</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td><td></td><td>used to check isolated capillaries</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools and Glassware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>resuspend pellet in BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>to mince brain tissue</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>to cover beaker and volumetric flask</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>to wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>60 mL syringe with Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>used with connector ring to filter capillaries</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>used for mincing</td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>50 mL volume, clearance: 150-230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL volume, clearance: 80-130 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td></tr><tr><td>pluriStrainers (pore size: 30 &amp;micro;m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Connector Ring</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>41-50000-03</td><td>reuse multiple time</td></tr><tr><td>1 L Volumetric Flask</td><td></td><td></td><td>for preparation of Isolation Buffer</td></tr><tr><td>1 L Beaker</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA</td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Schott Bottle (60 mL)</td><td></td><td></td><td>for preparation of Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td>to keep everything cold</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td></td><td></td><td>for mincing of brain tissue</td></tr><tr><td>Tissue Culture Cell Scraper</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89260-222</td><td>to remove supernatant after centrifugation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraction V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647-500g</td><td>prepare in DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td></tr><tr><td>DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>to adjust pH of the DPBS</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Concentration: 1 mM</td></tr></tbody></table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Comprendere la funzione di barriera emato - encefalica in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche è critica per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche che promettono di migliorare la fornitura di droga del cervello, migliorare la protezione del cervello e trattare il cervello disturbi. Tuttavia, studiare la funzione umana barriera emato - encefalica è impegnativo. Così, c'è un bisogno fondamentale per modelli appropriati. A questo proposito, capillari cerebrali isolati da tessuto cerebrale umano rappresentano uno strumento unico per studiare la funzione di barriera come vicino alla situazione umana in vivo come possibile. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari dal tessuto di cervello umano a un alto rendimento e con purezza e qualità costante. I capillari sono isolati dal tessuto di cervello umano fresco mediante filtrazione, centrifugazione in gradiente di densità e omogeneizzazione meccanica. Dopo l'isolamento, i capillari del cervello umano possono essere utilizzati per varie applicazioni tra cui saggi di perdite, live cell imaging e le analisi basate su immunitario per studiare l'espressione della proteina e funzione, l'attività enzimatica o segnalazione intracellulare. Cervello umano isolato capillari sono un modello unico per delucidare il regolamento della funzione umana barriera emato - encefalica. Questo modello può fornire intuizioni nella patogenesi del sistema nervoso centrale (SNC), che aiuterà lo sviluppo di strategie terapeutiche per il trattamento di disordini dello SNC.

Gli isolamenti da tessuto cerebrale umano resa una sospensione arricchita nei capillari del cervello umano (Figura 1B) con piccole quantità di navi più grandi, cellule di anima rosse, altre cellule singole e alcuni detriti cellulari. Alcuni capillari sono ramificati, e, in alcuni, globuli rossi sono intrappolate in lumen capillare. Il capillare tipico ha un diametro di 3 – 7 µm ed è circa 100-200 µm lungo con lumen aperta; la maggior parte delle estrem...

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Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Views.  University of Kentucky. Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

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Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Purificazione delle navi cervello di topo

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

Isolamento affidabile dei micronavi del sistema nervoso centrale in cinque gruppi di vertebrati

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Coltura di periciti capillari cerebrali per misurazioni citosoliche del calcio e studi di imaging del calcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Biologia

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Un metodo ad alta uscita per isolare i periciti cerebrali dal mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue

Source: Hartz, A. M. S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57346" target="_blank">Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of cerebral capillaries from a fresh human brain tissue. The isolated capillaries can then be used to generate an ex vivo blood brain barrier model.

Isolamento dei capillari cerebrali dal cervello umano: un metodo ottimizzato per estrarre i capillari cerebrali dal tessuto cerebrale umano

Source: Hartz, A. M. S. et al. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Ricerca sul cancro

Cancers of the Nervous System

Ex vivo studies

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Isolamento e coltura di periciti cerebrali primari: una procedura per isolare e coltivare periciti da capillari cerebrali bovini senza contaminazione delle cellule endoteliali

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...

In vitro studies

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

Source: Nielsen, S. S. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56277">Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

Purificazione dei capillari da un cervello suino

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Purification of Porcine Brain ...

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

Un metodo per l'isolamento delle unità neurovascolari dal cervello di ratto

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...