Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

우리 감사 피터 넬슨 박사 소냐 앤더슨 모든 인간의 뇌 조직 샘플을 제공 하기 위한 영국 ADC 뇌 조직 은행에서 인정 하 고 (번호를 부여 하는 NIH: 노후화에 국가 학회에서 P30 AG028383). 우리 감사 매트 기능 및 톰 고 언, 정보 기술 서비스, 교육 기술 및 교직원 참여, 켄터키의 대학 그래픽 지원. 이 프로젝트는 (A.M.S.H.)에 노화 국립 연구소에서 보조금 번호 1R01AG039621와 부여 번호 1R01NS079507 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 (B.B.)에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 노화에 대 한 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 또는 국립 연구소의 공식 견해를 대표 하지 않는다. 저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

아래 내용은 현재 안전 및 규제 표준 켄터키의 대학, 렉 싱 턴, 켄터키, 미국에서 기반으로 합니다. 안전 예방책으로 서 인간의 조직으로 작업 하기 전에 기관의 생물 안전 프로그램 최신 규정 및 권장 사항을 참조 하십시오.
주의: 인간의 조직 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 및 다른 사람을 포함 하 여, 혈액을 매개로 병원 균의 원천이 될 수 있습니다. 인간의 조직 사용 혈액을 매개로 병원 체 감염의 위험을 포즈. 따라서, 특정 규제 및 안전 고려 사항은 실험실 직원을 보호 하기 위해 인간의 조직 작업할 때 필수적입니다. 미국에서 인간의 조직 작업 biosafety 수준 2 실험실 안전 조치 및 NIH 섹션 IV-B-7, 1970 절 5(a)(1) 및 사용자의 기관 생물 안전 프로그램의 OSHA Act에 따라 훈련을 요구 한다. 일반적으로, 인간의 물질 (조직, 체액)와 관련 된 어떤 연구를 수행 하기 전에 기관 Biosafety 위원회 및 기관 검토 위원회의 승인을 얻어야 합니다. 훈련과 인간의 재료를 사용 하는 모든 직원에 대 한 필요 포함 되어 기본적인 실험실 안전 교육, 예를 들어, 화학 위생 및 실험실 안전, 생물 안전, 유해 폐기물, 그리고 인간의 구체적인 훈련 혈액을 매개로 병원 균 인간의 재료를 사용 하는 모든 직원은 인간의 재료로 작업 전에 B 형 간염 예방 접종을 얻으려면 좋습니다. 인원은 인간의 물질, 예를 들어작업 하는 동안 특정 개인 보호 장비를 착용 하는 데 필요한., 수 갑을 차고 실험실 코트와 얼굴 방패, 그리고 항상 장갑을 착용. 모든 작업 biosafety 내각 (클래스 2)에서 수행 됩니다. 모든 장비에 인간의 재료와 접촉 하 고 어떤 폐기물에서 나오는 인간의 물질 오염 및 직원의 감염을 방지 하기 위해 적절 하 게 처리 됩니다. 모든 장비 및 표면 10% 표 백제와 75% 에탄올 인간의 재료를 포함 하는 각 절차에 따라 청소 됩니다. 인간의 자료 유출 즉시 청소 되어야 한다. 유리는 압력가 마로 소독 후 사용. 폐기물, 고정 되지 않은 인간의 조직를 포함 하 여 레이블이 지정 된 생물 학적 쓰레기 봉투에 수집 이며 압력가 마로 소독. Sharps로 유해 표시 펑크 및 누출 방지 용기에 수집 됩니다. 인간의 물질 로부터 모든 폐기물 기관의 생물 안전 규정에 따라 삭제 됩니다.
참고: 우리의 실험실 노후화에 샌 더 스 브라운 센터를 통해 고 인된 개인에서 신선한 담당 샘플을 얻습니다 (IRB #B15-2602-M). 포함 기준은: 영국-ADC 경도 부검 코 호트 연구와 사후 간격 (PMI) ≤4 등록 h64. 표준 프로토콜에 따라 부검 하 고 모든 절차 준수 NIH Biospecimen 최상의 연습 지침65. 4 h 보다는 더 적은의 짧은 PMI 격리 후 모 세관 생존 능력을 보장 하기 위해 가장 중요 한 것입니다. 신선 하 고 냉동 조직을 사용할 수 있습니다. 어 필요한 경우, 갓 얻은 인간의 뇌 조직 충격-액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장 신선한 또는 해 동 조직 절연 버퍼 (아래 참조)에 저장 하 고 신속 하 게 처리 해야 합니다. 우리는 신선한 인간의 조직 수익률 뇌 모세 혈관 (젖은 중량)의 약 100 밀리 그램의 10 g을 찾으십시오.
1입니다. 설치
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버퍼 준비 참고: 필요한 버퍼의 양 조직의 크기에 따라 달라 집니다. 다음 프로토콜에서 모든 버퍼 볼륨 인간의 뇌 피 질 조직의 10 g를 기반으로 합니다.<ol>
<li>L 절연 버퍼: 사용 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS; 2.7 m KCl, 1.47 m m KH2포4, 136.9 m NaCl, 8.1 m 나2HPO4m, 0.9 m m CaCl2, 0.49 m m MgCl2m m)의 1.5 L와 5 m D-포도 당 (1.35 g 보충 )와 1 m m 나트륨 pyruvate (0.165 g). 포도 당 및 pyruvate를 추가한 후 수산화 나트륨으로 pH 7.4에 조정 합니다. 쿨 하 고 버퍼 사용 하기 전에 4 ° C에 저장 합니다.</li>
		<li>소 혈 청 알 부 민 (BSA): 1%의 최종 BSA 농도에 절연 버퍼의 1 l BSA 가루 10 g를 추가 합니다. 거품을 피하기 위해, pH 7.4, 조정 및 4 ° C에서 밤새 껏 저장를 천천히 저 어. 바로 이전에 사용 하 고, 부드럽게 저 어; 알 부 민 변성을 피하기 위해 거품을 형성 하지 마십시오.</li>
		<li>밀도 그라데이션 매체: 유리 병에 밀도 그라데이션 매체의 18 g를 무게 그리고 자석 저 어 바 추가. 절연 버퍼의 60 mL을 추가 하 고 모든 분말 일시 중단 될 때까지 5 분 동안 적극적으로 악수. 저장소 밀도 그라데이션 중간 해산 있도록 4 ° C에서 하룻밤. 바로 사용 하기 전에 10 분 동안 저 어.</li>
		<li>4 ° C에서 모든 버퍼 저장 전체 격리 절차 동안 모든 도구와 얼음에 버퍼를 유지. 사용 하기 전에 모든 버퍼를 저 어.</li>
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실험적인 체제
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<li>탑재 전자 오버 헤드 교 반기에 포터 Elvehjem 조직 분쇄기의 유 봉. 후드 아래 얼음에 유 봉과 포터 Elvehjem 조직 분쇄기와 Dounce 균질 화기를 배치 합니다. 300 µ m 필터 메쉬 (5 x 5 cm2)를 준비, 콘, 배 고 삽입 하 고 50ml 테이프 (그림 1A)와 팔 콘 튜브를 연결.</li>
		<li>연결 고리를 놓고 긴장 필터 셀 (기 공 크기: 30 µ m) 50 mL 송 골 매 관에. 유해 쓰레기 봉투를 준비 합니다. 필요한 모든 장비는 biosafety 내각 장소 ( 테이블의 자료를 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 두뇌 샘플 준비
참고: 그림 1A 아래 설명 하는 전체 격리 절차의 워크플로 차트를 보여 줍니다. 인간의 뇌 조직 피 부분에서 줄기 수 있습니다 그리고 신선 또는 냉동 사용할 수 있습니다. 고정된 뇌 조직 (아무 버퍼; ~ 30 분 10 g) 실 온에서 해 동 될 수 있습니다. 비교 결과 얻기 위해 뇌 조직 각 실험에 대 한 같은 뇌 영역에서 얻을 수 한다. 이 프로토콜은 신선한 최적화 (PMI < 4 h) 동결 되지 인간의 대뇌 피 질.
<ol><li>인간 뇌 조직의 준비: 뇌 조직의 무게를 문서화. 다음 프로토콜에서 모든 숫자는 10 g의 신선한 인간의 뇌 조직에 적합 합니다. 뇌 조직을 100 mm 페 트리 접시에에서 놓습니다. 집게와 모든 meninges를 조심 스럽게 제거. 메스를 사용 하 여 백색 질을 잘라.</li>
	<li>인간의 뇌 조직의 닦지: 신중 하 게 자르고 뇌 조직을 메스로 말하다. 약 5 분 (2-3 m m 조각)을 말하다. 뇌 조직의 포터 Elvehjem 조직 분쇄기를 전송 합니다. 절연 버퍼의 30 mL를 추가 합니다. 참고: 다진된 조직 조각은 뇌 조직의 고기 저 미는 과정 아니 셨 변신 이후 볼 어렵다.</li>
</ol>3입니다. 균질
<ol><li>포터 Elvehjem 조직 분쇄기 (정리: 150-230 µ m): 50 rpm의 균질 화기 속도로 100 선으로 각 샘플을 균질. 모든 25 획과 100 타에 필요한 총 시간 시간을 문서화 합니다. 제안 된 균질 프로토콜; 표 1 을 참조합니다 인간의 전 두 엽 피 10 g을 조직에 대 한 총 시간은 약 22 분입니다. 공기 거품을 방지 하기 위해 저 어 하지 마십시오.</li>
	<li>Dounce 균질 화기 (정리: 80-130 µ m): 얼음 Dounce 균질 화기는 homogenate 전송. 20 획 (~ 6 s/스트로크, ~ 2 분의 총)와 정지 균질 거품을 하지 마십시오.</li>
</ol>4입니다. 원심 분리
<ol><li>4 50 mL 원심 분리 관 및 문서는 homogenate의 전체 볼륨으로 뇌 homogenate를 동등 하 게 배포 합니다. 원심 분리 튜브 (12.5 mL 튜브 당) 50 mL 밀도 그라데이션 버퍼를 배포 합니다. 절연 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 유 봉과 균질 화기, 린스와 4 개의 원심 튜브 (튜브 당 ~2.5 mL)로 배포.</li>
	<li>단단히 원심 분리기 튜브 뚜껑을 닫습니다. 적극적으로 튜브를 떨고에 의해 homogenate, 밀도 그라데이션 중간, 그리고 버퍼를 믹스. 4 ° C (고정된 각도 터);에서 15 분 동안 5800 x g 에서 원심 튜브에 연결 된 펠 릿을 계속 중간 감속 속도 선택 합니다. 삭제는 상쾌한 고 1 %BSA 2 mL에 각 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>5입니다. 여과
참고: 모세 혈관 붉은 혈액 세포와 다른 세포 파편에서 별도로 여러 필터링 단계가 필요 하다.
<ol><li>300 µ m 메시: 펠 릿을 다시 중단 후 필터링 300 µ m 메시를 통해 서 스 펜 션. 반면 큰 배 및 더 큰 두뇌 파편 메쉬에 남아 모세 혈관 망, 통해 필터링 됩니다. 메시 1 %BSA 최대 50 mL를 조심 스럽게 씻는 다. 메쉬를 삭제 합니다. 참고:이 여과 단계 어떤 큰 혈관 또는 뇌 파편의 덩어리에서 모 세관 정지를 지웁니다.</li>
	<li>
30 µ M 세포 변형 필터 참고:이 여과 단계 적혈구와 뇌 파편 다른에서 모세 혈관을 분리합니다.<ol>
<li>5 30 µ m 세포 변형 필터 (셀 스트레인 필터 당 모 세관 여과 액의 약 10 mL) 이상 단계 6.1에서에서 모 세관 여과 액을 배포 합니다. 반면 붉은 혈액 세포, 다른 단일 세포 및 작은 두뇌 파편 필터를 통과 하 고는 filtrate에 수집 되어 모세 혈관이이 필터에 의해 다시 개최 됩니다.</li>
		<li>각 필터 1 %BSA 25 mL로 씻는 다. 나중에, 수확량을 증가 시키기 위해 6 필터 모든 filtrates 붓는 다. 1 %BSA; 50 mL와 각 필터 세척 셀 변형 필터는 모 세관을 포함 하 고는 여과 액을 버리고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 모 세관 컬렉션
<ol><li>거꾸로 필터를 설정 하 고 각 필터에 대 한 1 %BSA 50 mL와 함께 모세 혈관 50 mL 튜브에 씻어. 부드럽게 피펫으로 팁 5 mL pipettor의 압력을 적용 하 고 필터를 씻어 뇌 모세 혈관에서 이동.</li>
	<li>특히 필터의 테두리에서에서 모든 뇌 모세 혈관을 씻어 있는지 확인 하십시오. 이후이 여과 과정을 더 어렵게 만든다 모 세관 손실의 기회를 증가 거품을 하지 마십시오.</li>
</ol>7입니다. 세척
<ol><li>모세를 수집한 후 원심 (양동이 터 스윙) 4 ° C에서 3 분 1500 x g 에서 모든 샘플. 상쾌한을 제거 하 고 다시 절연 버퍼의 약 3 mL에 펠 릿을 중단. 15 mL 원뿔 튜브에 하나의 샘플에서 모든 resuspended 펠 릿을 결합 하 고 절연 버퍼 채우기. 다시 4 ° C에서 3 분 1500 x g 에서 원심과 두 번 더 세척.</li>
	<li>현미경 (100 X 배율)와 카메라 (그림 1B) 모 세관 순도 문서화 합니다. 참고: 인간 뇌 조직의 10 g에서 뇌 모 세관 수확량은 일반적으로 약 100mg 이다. 격리 된 뇌 모세 혈관 실험, 처리에 대 한 지금 사용할 수 있습니다 (예., lysate, 막 분리), 또는 플래시-냉동 고에 최소 6-12 개월 (여러 freeze-thaw 주기 방지)에 대 한 cryotubes-80 ° C에 저장.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜 신선한 조직에서 그대로 하 고 가능한 인간의 두뇌 모세 혈관의 격리를 설명합니다. 이 섹션에서 우리에 대해 자세히 다음: 1) 프로토콜, 2) 일반적인 오류 문제 해결, 3) 기술의 한계, 4) 기존 기준 모델 및 대체 혈액-뇌 장벽 모델의 중요성에 대 한 수정 및 5) 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관에 대 한 잠재적인 응용 프로그램입니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 신선한 ...

혈액-뇌 장벽 혈액과 무슨 들어가는 및 두뇌에서 결정 하는 뇌 간의 긴밀 하 게 제어 인터페이스입니다. 해부학, 내 피 세포 혈액-뇌 장벽을 구성 하 고 복잡 한, 지속적인 모 세관 네트워크를 형성 한다. 순수,이 모 세관 네트워크는 동시에 이산화탄소와 대사 폐기물의 처분 하는 동안 산소와 영양소와 뇌를 제공 합니다. 중요 한 것은, 증거는 배리어에 변화 Alzheimer의 질병, 간 질, 및 뇌졸중1,2,3,,45 를 포함 하 여 수많은 병 리에 기여 지원 , 6 , 7. 뇌 내 피 세포도 예뇌에 약물 흡수를 차단 하 여 치료에 방 벽으로 봉사., 화학 요법 세포종 님 다음 종양 절제술8,9, 의 10. 이와 관련, 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관 대표는 독특한 비보 전 혈액-뇌 장벽 모델을 밀접 하 게 유사한 방 벽 속성 vivo에서, 장벽 기능 및 건강 장애의 연구에 대 한 수 있는 그리고 질병입니다. 이 문서에서 우리는 프로토콜 일관 되 게 높은 품질을 모 세관에 인간의 뇌에서 뇌 모세 혈관을 분리 하 고 혈액-뇌 장벽 공부 항복을 제공 합니다.
1969 년에, Siakotos 외. 11 뇌 모세 혈관 밀도 그라데이션 원심 분리와 유리 구슬 열 분리를 사용 하 여 소 하 고 인간의 뇌 조직에서의 격리를 보고 하는 첫번째 이었다. 나중에, 골드 스 테 인 외. 12 조직의 포도 당 수송의 신진 대사 활동을 유지 하면서 쥐에서 고립 뇌 모세 혈관을 공부 하는 데 필요한 금액을 줄이기 위하여 여러 여과 단계를 추가 하 여이 메서드를 향상. 그 이후, 연구자 최적화 모 세관 격리 절차 여러 번, 각 반복13,,1415방법과 뇌 모 세관 모델을 개선. 예를 들어 Pardridge은 외. 16 소 모 세관 기계적 균질, 보다는 오히려 소화 효소를 사용 하 여 격리 하 고 이후에 전달 210 µ m 메쉬 필터와 유리 구슬 열을 통해 모 세관 서 스 펜 션. 이러한 수정 고립된 뇌 모세 혈관의 trypan 블루 제외 얼룩을 개선 하 고 따라서 내 피 세포 생존 능력을 증가. 1990 년대 초에, Dallaire 외. 17 격리 소 및 쥐 모 세관 신경 오염의 명확 했다 고 γ glutamyl transpeptidase (γ-GTase)와 알칼리 성 인산 가수분해 효소의 대사 활동을 유지. 2000 년에, 밀러 외. 18, 모세 혈관의 루멘으로 전송 기판의 축적을 보여 confocal 현미경 검사 법와 함께에서 고립 된 쥐와 돼지의 뇌 모세를 사용. 그 후, 우리의 실험실 뇌 모 세관 격리 절차를 최적화 하기 위해 계속 하 고 우리는 P-당단백질 (P-gp)19,,2021, 유방암을 결정 하기 위해 전송 분석 설립 저항 단백질 (BCRP)22,23, 그리고 다중 약물 저항 단백질 2 (Mrp2)24 전송 활동. 2004 년, 우리는 우리가 다양 한 신호 경로 조사 하기 위해 고립 된 쥐 뇌 모세 혈관을 사용 하는 두 가지 보고서 출판. 츠 외에 21, 우리는 펩 티 드 endothelin 1 신속 하 고 역 감소 뇌 모세 혈관 endothelin 수용 체 B (동부 표준시B) 수용 체, 산화 질소 synthase (NOS), 그리고 단백질 키 니 아 제 C 통해 행동에 의해 (PKC)에서 P의 gp 전송 기능 발견. 바 우 어 외 에 19, 우리 핵 수용 체 pregnane X 수용 체 (PXR)의 표현과 보였다 PXR 변조 뇌 모세 혈관에서 P의 gp 식 및 전송 기능을 시연 했다. 유전자 변형 인간 답게 PXR 마우스 실험에서 우리 연구의이 라인을 확장 하 고 hPXR 활성화25통해 upregulating P-gp에 의해 방 벽의 강화 vivo에서 보여주었다. 2010 년에 츠 외. 26 P gp 단백질 표정 복원 및 수송 행복해 overexpress 유전자 변형 인간 녹말 체 선구자 단백질 (행복해) 생쥐에서 활동이 접근이 방식을 사용. 또한, P의 gp 행복해 복원 마우스 크게 감소 녹말 체 beta (Aβ)40와 Aβ42두뇌 수준.
신호 경로, 공부 뿐만 아니라 모 세관 누설을 지칭 하는 모 세관 침투성에 있는 변화를 결정 하 고립 된 뇌 모세 혈관을 사용할 수 있습니다. 특히, 텍사스 레드 누설 시험 시간 및 이러한 데이터 모 세관 루멘에서 텍사스 레드는 누설 률을 분석 하는 데 사용 하는 형광 염료의 누출을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 증가 모 세관 누설 률 제어 모 세관에서 그에 비해 혈액-뇌 장벽2의 물리적 무결성에 변화를 나타냅니다. 이것은 가치가 장벽 장애, 예를 들어와 관련 된 수많은 질병 상태 이기 때문에., 간 질, 다 발성 경화 증, 알 츠 하이 머 병, 그리고 외상 성 뇌 부상27,,2829, 30. 다른 그룹 또한 단백질 표정 및 단백질31,32,,3334의 전송 활동 신호 경로 분별 하 고립 된 모 세관 이용 35,,3637. 마지막으로, 우리는 인간의 뇌 모세 혈관의 격리에 대 한이 메서드를 최적화 하기 위해 지속적으로 그리고, 최근에, 우리가 보여주었다 증가 P gp 식 환자에서 인간의 혈액-뇌 장벽에서 간 질 발작-무료 제어 개인38에 비해 . 함께 찍은, 이러한 발전 고립된 뇌 모세 혈관 장벽 기능을 공부 하는 다재 다능 한 모델으로 사용할 수 있습니다 보여줍니다.
Vivo에서, ex vivo, 및 혈액-뇌 장벽 모델 생체 외에서 다양 한 기초 연구와 산업 약물 검사, 약물 전달 뇌39,40,41에 테스트 목적으로 주로 사용 된 ,42,,4344. 격리 된 비보 전 뇌 모세 혈관, 뿐만 아니라 현재 혈액-뇌 장벽 모델 포함 철에 모델, 체 외에서 세포 배양 고립된 뇌 모 세관 내 피 세포 또는 다양 한에서 불멸 하 게 셀 라인의 종, 뇌 모 세관 내 피 세포, 및 칩에 미세 모델으로 차별화 하는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 생체 외에서 문화.
실리콘에서 모델 예측된 흡수, 분포, 대사, 배설 (ADME) 속성에 따라 약 후보자를 선택 하기 위한 약물 개발에 가장 일반적으로 사용 됩니다. 양이 많은 구조 재산 관계 (QSPR) 모델 같은 양이 많은 구조 활동 관계 (굽기) 모델은 라이브러리의 높은 처리량 검열에 사용 하는 약물의 뇌 침투를 예측 하는 인기 있는 방법 45 , 46.이 모델은 화면 분자 배리어 관통 속성에 대 한 유용.
베 츠 외. 47 는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 모델 시스템으로 교양된 뇌 모 세관 내 피 세포의 monolayers를 설립. 인간의 대뇌 microvessel 내 피 세포 (hCMECs) 등 신선한 조직 또는 불멸 하 게 내 피 세포를 사용 하 여 셀 문화 모델 생체 외에서 뇌 침투 또는 기계 론 적인 연구에 대 한 또 다른 높은 처리량 검열 도구 수 있습니다. 그러나, 뇌 모 세관 내 피 세포 문화 모델 모 세관 루멘 내의 혈의 생리 전단 응력 부족, 전반적인 생물 학적 복잡성에 제한 됩니다 및 식 및 중요 한 장벽 부품의 지역화에 변화를 받아야 꽉 접합 단백질 같은 표면 수용 체, 전송기, 효소, 그리고 이온 채널48,,4950. 반대로, 내 피 monolayers hPSCs에서 파생 된, hCMEC/D3 문화에 비해 낮은 자당 침투성이 있고 일부 혈액-뇌 장벽 전송기, 접착 분자, 그리고 단단한 접속점51, 의 편광된 식 포함 그러나 52., 이러한 셀 속성에에서 변경 될 수 있으며 시스템 장벽 속성52 vivo에서 의 재현 부에 대 한 유효성을 검사 해야 합니다.
혈액-뇌 장벽 연구의 최신 동향 등 인공 모세 혈관, 기관-온-칩 기술을 사용 하 여 미세 장치 생성 또는 빈 섬유 기술53, 를 활용 하 여 만드는 3D 조직 문화 시스템을 활용 하 여 54 , 그러나 55. 인공 모세 혈관,, 있다 뇌 모세 혈관 (3-7 µ m) 보다 훨씬 더 큰 직경 (100-200 µ m). 따라서, 전단 세력에는 생체 외에서 할 하지 완전히 닮은 vivo에서 상황. 이것은 "blood-brain-barrier-on-a-chip" 미세 장치, 미세 전단 힘을 생성 하는 이러한 장치를 통해 인공 막 형태 "피"와 "두뇌" 구획 및 유체 펌핑은 해결 되었습니다. 마찬가지로, 다양 한 조합 이다와 내 피 세포와 혈관 평활 근 세포의 공동 문화 또한 사용 되었습니다 빈 섬유 기술을 vivo 조건56 에서 존재 하는 유 변 학적 매개 변수를 다시 , 57 , 그러나 58., 그것은 불분명이 모델 혈액-뇌 장벽 교통, 신진 대사, 신호, 등 등의 다른 속성을 반영 하는 얼마나 잘. 이러한 인공 모 세관 및 칩 모델은 약물의 높은 처리량 검열에 적합 하지만 이러한 모델을 생성 하는 데 사용 되는 세포 문화 중 변경 될 수 있습니다.
고정 및 고정 뇌 조각 또는 모 세관 내 피 세포 배양인간 microvasculature 연구5,59,,6061하는 데 사용할 수 있는 추가 모델은 기본 두뇌. 예를 들어 고정된 뇌 조직의 immunohistochemistry 단백질 지역화가 결정 하는 데 사용은 고 식 건강 한 병에 걸리는 조직에 비해.
조직 조각 및 생체 외에서 모델 위에서 설명한, 갓 고립 뇌 모세 혈관 혈액-뇌 장벽 기능을 공부에 활용할 수 있습니다. 신선한 인간의 뇌 조직, 얻을 하는 데 어려움이 고립 된 모 세관 모델의 포함 이다 신경, 그리고 상대적으로 시간이 많이 걸리는 격리 프로세스의 부재. 격리 된 뇌 모 세관 모델의 한 장점은이 모델 밀접 하 게 비보에 상황을, 따라서, 장벽 기능 및 역 기능 특성을 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 그것은 또한 신호 메커니즘을 사용 하 여 다양 한 분석 및 분자 기법3,19,,6263분별을 사용할 수 있습니다.
우리의 실험실 권한이 모두 신선 하 고 냉동 인간 두뇌 조직에 노화에 샌 더 스 브라운 센터를 통해 (IRB #B15-2602-M)64. 이러한 맥락에서 부검 표준 프로토콜에 따라, 두뇌에서 얻을 수 있습니다 < 4 h, 및 모든 절차 준수 NIH Biospecimen 최상의 연습 지침65. 인간의 뇌 조직에이 독특한 접근을 감안할 때, 우리는 설립 하 고 그대로, 가능한 인간의 두뇌 모세 혈관의 고수익에 결과 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 프로토콜을 최적화. 관심의 두 가지 일반적인 끝점 단백질 식 및 활동을 결정 하는. 이와 관련, 우리와 다른 단백질 표정 활동 레벨을 공부 하 고 격리 된 뇌 모세 혈관으로 사용할 수 있는 다양 한 분석을 설립 했다. 이 분석 실험 등 서 부 럽, 간단한 서양 분석 결과, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), zymography, 전송 활동 분석 실험, 그리고 모 세관 누설 분석 실험입니다. 이 분석 실험 허용 인간 pathologic 상태에서 장벽 기능에 변화를 공부 단백질 식 및 활동, 관리 하는 경로 확인 하 고 혈액-뇌 장벽 관련 치료에 대 한 약리학 적인 목표를 식별 하 연구원 질병입니다.
함께, 갓 찍은 고립된 뇌 모세 혈관 혈액-뇌 장벽의 강력 하 고 재현 가능한 모델로 사용할 수 있습니다. 특히,이 모델 다양 한 장벽 기능을 공부 하는 끝점을 확인 하기 위해 많은 다른 분석 실험 결합 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Personal Protective Equipment (PPE)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Disposable Protective Labcoats</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td></tr><tr><td>Face Shield, disposable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>19460102</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td></tr><tr><td>Safety Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Paper 18&quot; x 20&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>to cover working areas</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>for used scalpels</td></tr><tr><td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.</td><td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C Refrigerator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscope</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td><td></td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td><td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>used to freeze the tissue?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analytical Balance</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td><td></td><td>used to check isolated capillaries</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools and Glassware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>resuspend pellet in BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>to mince brain tissue</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>to cover beaker and volumetric flask</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>to wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>60 mL syringe with Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>used with connector ring to filter capillaries</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>used for mincing</td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>50 mL volume, clearance: 150-230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL volume, clearance: 80-130 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td></tr><tr><td>pluriStrainers (pore size: 30 &amp;micro;m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Connector Ring</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>41-50000-03</td><td>reuse multiple time</td></tr><tr><td>1 L Volumetric Flask</td><td></td><td></td><td>for preparation of Isolation Buffer</td></tr><tr><td>1 L Beaker</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA</td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Schott Bottle (60 mL)</td><td></td><td></td><td>for preparation of Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td>to keep everything cold</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td></td><td></td><td>for mincing of brain tissue</td></tr><tr><td>Tissue Culture Cell Scraper</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89260-222</td><td>to remove supernatant after centrifugation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraction V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647-500g</td><td>prepare in DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td></tr><tr><td>DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>to adjust pH of the DPBS</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Concentration: 1 mM</td></tr></tbody></table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

생리 및 병 태 생리 조건 이해 혈액-뇌 장벽 함수는 두뇌 약물 전달 향상, 두뇌 보호, 개선 및 두뇌 치료 약속을 잡고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 중요 한 장애입니다. 그러나, 인간의 혈액-뇌 장벽 기능을 공부 하 고 도전 이다. 따라서, 적절 한 모델에 대 한 중요 한 필요는. 이와 관련, 뇌 모세 혈관 뇌 조직에서 분리 가능한 상황 인간의 vivo에서 가까운으로 장벽 기능을 공부 하는 독특한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 일관 된 품질과 순도 높은 수확량에서와 인간의 뇌 조직에서 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 모세 혈관에서 신선한 인간의 뇌 조직의 기계적 균질, 밀도 기울기 원심 분리, 여과 사용 하 여 격리 됩니다. 격리, 후 인간의 뇌 모세 혈관 단백질 표정 그리고 기능, 효소 활동, 또는 세포내 신호를 공부 하 누설 분석 실험, 라이브 셀 이미징 및 면역 기반 분석 등의 다양 한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. 고립 된 인간의 두뇌 모세는 인간의 혈액-뇌 장벽 기능의 규정 명료 하 독특한 모델입니다. 이 모델은 중앙 신경 조직 (CNS) 병 인, CNS 질환 치료를 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것입니다에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

인간의 뇌 조직에서 격리 큰 혈관, 적혈구, 다른 단 세포와 일부 세포 파편의 작은 양의와 인간의 뇌 모세 혈관 (그림 1B)에 농축 현 탁 액을 산출 한다. 일부 모 세관, 분기 하 고, 일부, 적혈구는 모 세관 루멘에서 속은. 일반적인 모 세관 3-7 µ m 직경을가지고 있으며 약 100-200 µ m 오픈 루멘;와 긴 대부분 모 세관 끝 축소 됩니다. Confocal 현미경 검사 법을...

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Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K 조회수.  University of Kentucky. 인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

비디오: Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

연구

신경과학

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

분리 및 대뇌 실질 세동맥의 캐 뉼러

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

생물학

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

마우스에서 대뇌 골후혈구를 분리하는 고출력 방법

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue

Source: Hartz, A. M. S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57346" target="_blank">Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of cerebral capillaries from a fresh human brain tissue. The isolated capillaries can then be used to generate an ex vivo blood brain barrier model.

인간 뇌에서 대뇌 모세혈관 분리: 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관을 추출하는 최적화된 방법

Source: Hartz, A. M. S. et al. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구학

Cancers of the Nervous System

Ex vivo studies

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

1차 뇌 주피세포의 분리 및 배양: 내피 세포 오염 없이 소 뇌 모세 세포에서 주피 세포를 분리하고 배양하는 절차

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...

In vitro studies

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

Source: Nielsen, S. S. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56277">Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

돼지 뇌에서 모세혈관 정화

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Purification of Porcine Brain ...

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

쥐의 뇌에서 신경혈관 단위를 분리하는 방법

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...