Tüm mikroskobu W. M. Keck mikroskobu merkezi Nathaniel Peters desteği ile ve NIH Ödülü S10OD016240 desteğiyle yapıldı. S.L.F. NIH K08AI119142 ve R21AI130281 tarafından desteklenir. Biz Dr Richard Flavell ve Dr. Brad Cookson caspase-1/11 eksik fareler için ve Dr. Brad Cookson laboratuvar tesisler ve ekipman paylaştığınız için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan yordamlar onaylanmış ve University of Washington kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi kuralları altında yürütülen.
1. kemik iliği hasat
<ol><li>Aseptik femur ve tibia bir fareden çıkarın ve steril aletlerin kullanma kemikleri temizleyin. Temizlenmiş kemikleri Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamisin sülfat + 10.000 U/mL penisilin/streptomisin + % 10 fetal Sığır serum (FBS, DMEM-10 tam) yerleştirin ve kuluçkaya 15 dakika buzda tüp.</li>
	<li>Makas kullanarak proksimal ve distal topu eklemler kaldırın. Kemikleri hollow orta ile dolu bir 10 mL şırınga bağlı 25 G iğne yerleştirin. Kemik iliği DMEM-10 tam kullanarak floş. Herhangi bir kümeleri yukarı ve aşağı yavaşça orta pipetting tarafından resuspend.</li>
	<li>Hücreler için 300 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Bu noktada, %90 FBS + % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hücreleri dondurmak veya 15 cm Petri kabına şartına L929 Orta (adım 2.1) kullanarak makrofajlar ayırt etmek için hücrelerde plaka.</li>
</ol>2. kemik iliği türevi makrofajlar farklılaşma
<ol><li>Önceden ısıtılmış farklılaşma Orta (DMEM-10 tam 21 mL ve Swanson vd tarafından açıklandığı gibi L929 koşullanmış hücrenin orta 9 mL kullanarak 18), kemik iliği hücreleri bir 15 cm koymak olmayan doku kültürü tedavi Petri kabına (1.2-1.5 x 107 hücreleri). 37 ° C ve % 5 CO2 plaka için 7 gün kuluçkaya. Ek bir 30 mL farklılaşma orta günde 3 ya da 4 plaka ekleyin. Not: makrofajlar ayırmak ve hasat zor olacak gibi bu doku kültürü tedavi kaplamalar, kullanmak önemlidir.</li>
	<li>Makrofajlar toplamak için fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile tabak yıkama ve 20 mL soğuk PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin. PBS + EDTA hücrenin üzerine pipetting hücreleri plaka 10 dk. hasat için 4 ° C'de kuluçkaya ve PBS 10 mL Tabağını yıka. Her iki birleştirme iki 15 mL konik tüpler içine yıkar.</li>
	<li>300 x g 10 dk de hücreleri santrifüj kapasitesi ve fenol kırmızısı ücretsiz DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-glutamin + 0,05 mM 2-mercaptoethanol + %5 10 mL hücrelerde resuspend FBS (DMEM-5) ve bir hemasitometre ya da bir Coulter sayaç kullanarak hücreleri saymak. Sayım sırasında hücreler buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Makrofajlar doku kültürü kaplı levha 2 x 105 hücre/mL, içinde tohum. Mikroskopi deneyler için 1 mL 24 iyi plakaları coverslips sayfasında bulunan bir hücreler tohum. Karaciğer yayın deneyleri için 96 iyi plaka hücrelerinin 100 µL tohum. Karaciğer tahlil için 9 wells (3 kuyu tedavi edilmezse, % 100 lizis kontrolleri ile 3 kuyu ve 3 kuyular için deneysel uyarıcı) tohum.</li>
	<li>Santrifüj 96 iyi plaka hücreleri belirli yapmak için 300 x g de 5 min için eşit derecede iyi arasında dağıtılmış.</li>
	<li>Gece saat 37 ° C + %5 CO2 plaka astar işlemine başlamadan önce kuluçkaya.</li>
</ol>3. astar
<ol><li>100 ng/mL LPS (500 μL de plaka 24 veya 50 μL de plaka 96) içeren orta taze Orta (DMEM-5) ile değiştirin. Not: TLR4-aracılı astar19uyarmak için yeteneği etkileyen LPS yapısal değişimler çeşitli vardır. LPS Salmonella minnesota R595 üzerinden (Re) birden çok satıcı mevcuttur ve tavsiye edilir.</li>
	<li>3 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
</ol>4. harekete geçirmek-in Nigericin ile NLRP3 Inflammasome ve FAM-YVAD-FMK ile etiketleme
<ol><li>Orta kaldırın ve DMEM-5 5 mikron nigericin ve 5 mM glisin içeren 290 μL ile değiştirin. Glisin caspase-1 harekete geçirmek5sırasında oluşur hücre lizis azaltmak için eklenir. 60 dk 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya. Vahşi türü ve caspase-1 eksik makrofajlar gözlenen etiketleme caspase-1 için belirli olduğundan emin olmak için kullanın.</li>
	<li>Son 45 dakika 30 10 μL eklemek x FAM-YVAD-FMK, üreticinin yönergelerine göre hazırlanmış.</li>
	<li>60 dk sonra orta kaldırmak ve hücreleri 5 dk her ile 1 mL soğuk PBS için üç kez yıkayın.</li>
	<li>Her şey için % 2 paraformaldehyde 250 μL ekleyin ve 30 dk için alüminyum folyo ile kaplı buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Son 5 dk çekirdeklerin etiketlemek için 0.2 mM far-red floresan nükleik asit leke 4 μL ekleyin. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) veya diğer boyalar da etiket DNA için kullanılabilir.</li>
	<li>Hücreleri üç kez 1 mL soğuk PBS ile yıkama ve coverslips 7 μL Anti-fade montaj orta kullanma mikroskop slaytlar üzerine monte. Montaj orta coverslip tırnak cilası kullanma mikroskop slayt için sızdırmazlık önce gece sertleşmesine izin.</li>
	<li>Makrofajlar tarafından confocal mikroskopi olabilir görüntü. EX / Em FAM-YVAD-FMK için 492/520nm ve 642/661 far-red floresan nükleik asit leke için. Mikroskobu tedavi edilmezse hücreleri herhangi bir arka plan 488 kanalda boyama gösterme gibi ayarlamak emin olun. Aksi durumda, arka plan FAM-YVAD-FMK boyama tespit ve gerçek değil active caspase-1 olur. Not: Mikroskop set-up 6 bölümünde anlatılan.</li>
</ol>5. antikor boyama
Not: ASC algılamak için antikorlar hücrelerle etiketlemek için tohum, Başbakan ve nigericin önceki bölüme aynı hücrelere ortaya çıkarmak. İşleme daha sonra aşağıdaki gibidir:
<ol><li>Hücreleri 5 dk her ile 1 mL soğuk PBS için üç kez yıkayın. 250 μL fiksasyon ve permeabilization çözüm ekleyin. Hücreler buz üzerinde kuluçkaya ve 30 dk için kapalı.</li>
	<li>Üç kez 5 min için her 1 mL ile yıkama arabelleği makrofajlar yıkayın.</li>
	<li>ASC karşı birincil antikor 250 μL 1:500 yıkama arabelleği seyreltilmiş ekleyin ve buz üzerinde 1 h için kuluçkaya. Birincil herhangi bir antikor almaz, ancak yalnızca ikincil alacaksınız bir coverslip içerir. Bu coverslip mikroskop Kur sırasında doğru uzaklığı ayarlamak için kullanılır.</li>
	<li>Hücreleri ile 1 mL yıkama arabellek her 5 min için üç kez yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikor (floresan boya konjuge keçi-anti-fare) 250 μL 1:500 yıkama arabelleği seyreltilmiş ve buz üzerinde 1 h için kuluçkaya ekleyin. Bu kuluçka son 5 min için 0.2 mM far-red floresan nükleik asit leke 4 μL etiket çekirdekler için ekleyin.</li>
	<li>3 hücreleri yıkama x 1 mL soğuk yıkama arabellek ve coverslips mikroskop üzerine slaytlar 7 μL Anti-fade montaj orta kullanarak bağlama ile. Coverslip açık oje kullanma mikroskop slayt için sızdırmazlık önce gece sertleşmesine montaj orta izin.</li>
	<li>Görüntü makrofajlar tarafından confocal mikroskobu. EX / Em ikincil antikor için 555/580 nm ve 642/661 far-red floresan nükleik asit leke (aşağıda açıklandığı gibi). Not: FAM-YVAD-FMK ve antikor etiketleme ile etiketleme Co yerelleştirilmesini etkin caspase-1 ve ASC göstermek için birleştirilebilir. Bunun için FAM-YVAD-FMK etiketleme için koşulları izleyin ve sonra daha fazla işlem için protokol etiketleme antikor geçin.</li>
</ol>6. Confocal mikroskobu tarafından etiketli makrofajlar görüntüleme
Not: coverslips gecede tedavi ve tırnak cilası ile mikroskop slayt mühürlü izin sonra lekeli hücreleri görülebilir. Burada, görüntüleme confocal mikroskop kullanılarak açıklanmıştır. Hücreleri de standart floresan mikroskopi tarafından görüntülenebilir.
<ol><li>Tedavi edilmemiş kontrol hücreleri içeren slaydı mikroskop sahnesinde yerini ve hücreleri mikroskobunun odaklan.</li>
	<li>Orada öyle ki hiçbir olumlu FAM-YVAD-FMK tedavi edilmezse hücrelerde boyama mikroskop bakmak kadar tablo (LUT) ayarları kullanarak, uzaklık ayarlayın. Bu işlem caspase-1 eksik makrofajlar kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Not: Uzaklık deneyde kullanılan her kanal için ayarlanması gerekir, ama doğru uzaklık ayarı FAM-YVAD-FMK kanal ve floresan antikor kanalları için en kritik. DNA kanal kenardan uzaklığı daha az önemlidir. Mahsup hesabı ayarladığınızda, bu ayarı deneme boyunca ayarlamak değil.</li>
	<li>Slayt geçiş yapmak için tedavi nigericin örnek. Pozitif ve negatif FAM-YVAD-FMK boyama için her iki hücre içeren bir alan bulun. Pozitif boyama en yüksek şiddeti vardır uçağa FAM-YVAD-FMK kanal görüntüleme uçak ayarlayın. Bu normalde inflammasome odak merkezi nerede görüntüsü uçak olacak.</li>
	<li>Öyle ki Foci yoğun çekirdeği olan hücrelerde görülebilir kazanç ayarlayın. Kazanç ve mahsup hesabı ayarladıktan sonra görüntüleme oturumun geri kalanı için bu ayarları bırakın. Not: bir hücre pyroptotic olup olmadığını belirlemek için bir kolay yolu nükleer morfoloji arıyor. Active caspase-1 içeren hücreleri yuvarlak ve yoğun çekirdeği nükleulus hücreleri caspase-1 harekete geçirmek ve nükleer morfoloji olmadan görünür iken, tedavi edilmemiş hücreleri benzer.</li>
	<li>Görüntü 100 X toplam büyütme 5 rasgele seçilen alan toplamak. Bu normalde görüntü başına yaklaşık 40 hücre sonuçlanır. Her örnek için bu işlemi yineleyin.</li>
	<li>Her görüntü görüntü analiz yazılımı kullanarak hücreleri saymak. Sonra olumlu FAM-YVAD-FMK boyama içeren hücreleri saymak. Caspase-1 etkinleştirme FAM-YVAD-FMK pozitif hücrelerinin yüzdesi olarak düzeyini temsil edecek.</li>
</ol>7. karaciğer yayın tahlil
Not: karaciğer yayın tahlil için tohum ve önceki bölümde açıklandığı gibi hücreleri hariç Başbakan 96 iyi tabak kullanın. Orta priming sonra kaldırmaz.
<ol><li>DMEM-5 10 mikron nigericin deneysel wells için ve 50 μL içeren 50 μL eklemek DMEM-5 spontan ve % 100 lizis denetim kuyuları için. Hedef hücre lizis ölçmek için olduğundan glisin bu deneyde eklemeyin. 60 dk 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya.</li>
	<li>30 dk sonra % 100 lizis denetim wells için 10 x lizis arabelleği 10 μL ekleyin ve DMEM-5 10 μL diğer wells ekleyin. Bu kuluçka sırasında substrat Mix (kurutulmuş substrat 1,5 mL) 1 flakon ve tahlil arabelleği (~ 12 mL) 1 aliquot dondurucudan kaldırmak ve ışıktan oda sıcaklığında korunan çözülme bildirin. Not: Kırmızı formazan ürün için dönüştürülür tetrazolium tuz (iodonitro-tetrazolium menekşe), substrat içermektedir.</li>
	<li>60 dk toplam kuluçka sonra plaka vasıl 500 x g 10 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi 50 μL süpernatant ile bir açık düz alt plaka aktarın. Bu süre içinde tahlil arabellek 12 mL substrat mix şişe ekleyin ve kullanmadan önce oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Her şey için 50 μL substrat ekleyin ve karanlıkta 30 dk için kuluçkaya. Orta tek kuyular için boş değerler içerir. Plaka 15 dakika sonra sinyal plaka okuyucu algılama sınırı aşan değil emin olmak için denetleyin.</li>
	<li>30 dk sonra durmak eriyik (1 M asetik asit) 50 μL ekleyin ve bir plaka okuyucu kullanarak OD490 ölçmek.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak hücre lizis yüzdesini hesaplamak: % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maksimum-spontan)) × 100 Deneysel: tedavi nigericin hücreleri; spontan: tedavi edilmezse hücreleri; en fazla: hücre lizis arabelleğe maruz</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jorgensen, I., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptotic+cell+death+defends+against+intracellular+pathogens.">Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens.</a> Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).</li><li>Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+action,+role+in+disease,+and+therapeutics.">Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics.</a> Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyroptosis:+host+cell+death+and+inflammation.">Pyroptosis: host cell death and inflammation.</a> Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages.">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li><li>Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+host+responses+during+pyroptosis:+caspase-1-dependent+lysosome+exocytosis+and+inflammatory+cytokine+maturation.">Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation.</a> J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NLRP3+inflammasome+activation.">Mechanism of NLRP3 inflammasome activation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).</li><li>Juliana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-transcriptional+priming+and+deubiquitination+regulate+NLRP3+inflammasome+activation.">Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation.</a> J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).</li><li>Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deubiquitination+of+NLRP3+by+BRCC3+critically+regulates+inflammasome+activity.">Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity.</a> Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).</li><li>Song, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+Phosphorylation+Is+an+Essential+Priming+Event+for+Inflammasome+Activation.">NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation.</a> Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).</li><li>Stutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+assembly+is+regulated+by+phosphorylation+of+the+pyrin+domain.">NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain.</a> J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).</li><li>Broz, P., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasomes:+mechanism+of+assembly,+regulation+and+signalling.">Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC+is+essential+for+LPS-induced+activation+of+procaspase-1+independently+of+TLR-associated+signal+adaptor+molecules.">ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules.</a> Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).</li><li>Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-1-induced+pyroptotic+cell+death.">Caspase-1-induced pyroptotic cell death.</a> Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).</li><li>LaRock, C. N., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Yersinia+virulence+effector+YopM+binds+caspase-1+to+arrest+inflammasome+assembly+and+processing.">The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing.</a> Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).</li><li>Swanson, M. S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Legionella+pneumophila+with+the+macrophage+endoplasmic+reticulum.">Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum.</a> Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).</li><li>Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS,+TLR4+and+infectious+disease+diversity.">LPS, TLR4 and infectious disease diversity.</a> Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).</li><li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flow+cytometric+method+to+assess+inflammasome+formation.">A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation.</a> J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).</li><li>Sester, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Inflammasome+Formation+by+Flow+Cytometry.">Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2016).</li><li>DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+cell+lysis+are+separable+events+during+pyroptosis.">Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis.</a> Cell Death Discov. , (2017).</li><li>Russo, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Caspase-1+Induces+Plasma+Membrane+Pores+That+Precede+Pyroptotic+Lysis+and+Are+Blocked+by+Lanthanides.">Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides.</a> J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).</li><li>Evavold, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pore-Forming+Protein+Gasdermin+D+Regulates+Interleukin-1+Secretion+from+Living+Macrophages.">The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages.</a> Immunity. , (2017).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu makale, biz inflammasome harekete geçirmek ve caspase-1 harekete geçirmek NLRP3 stimülasyon fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde takip sonucu incelemek için iki teknik sundu. İlk teknik caspase-1 etkinleştirme floresan muhabir FAM-YVAD-FMK hücresel bağlamında düzeyini belirlemek araştırmacı sağlar. Bu muhabir caspase-1/11 eksik makrofajlar boyama yokluğu tarafından görüldüğü gibi enzimlerin caspase-1 Aile bağlama için çok özel. Özgüllük LaRock ve arktarafından da gösteri...

Inflammasome-aracılı iltihap patojen organizmalar1karşı savunma bir kritik bileşenidir ama aynı zamanda pek çok hastalıkları2etyolojisinde altında yatan. Hasar moleküler modelleri (DAMPs) ilişkili veya çok çeşitli enfeksiyonların inflamatuar yanıt patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) sitozolik algılama tarafından tetiklenir. Desen tanıma reseptörleri (PRR), NOD benzeri reseptör (NLR) aile üyeleri de dahil olmak üzere bu algılama PAMPs ve DAMPs oligomerize. Bu PRR, apoptozis ile ilişkili leke gibi protein içeren bir C-terminal caspase-işe alım etki alanı (kart) (ASC) ve yanlısı şeklinde adaptör protein içeren inflammasome olarak adlandırdığı bir çok protein kompleksi oluşumunu tetikler caspase-13,4. Bu karmaşık yakınlık kaynaklı auto-harekete geçirmek-in caspase-1 sağlar. Active caspase-1 sonra özelliği inflamatuar hücre ölüm yolu pyroptosis olan olayları yol açar. Bu olaylar şunlardır: bölünme ve inflamatuar sitokinlerin IL-1β ve IL-18, lysosome ekzositozu ekstrasellüler boşluk, nükleer yoğunlaşma ve gasdermin D bölünme lizozomal İçindekiler sürümüyle serbest bırakılması. Plazma membran rüptürü ve yayın patojen çoğaltma5, için koruyucu bir niş zannetme yanı sıra inflamatuar İçindekiler neden gözenekleri oluşturan plazma zarı gasdermin D yayımlanan N-terminal alanı ekler 6 , 7.
Burada, iyi okudu NLRP3 inflammasome ele. NLRP3 inflammasome aktivasyonu ile iki adımlı işlem8oluşur. İlk "macun" adım tanıma programını Toll benzeri reseptörler bir mikrobiyal ürünün tarafından (TLR) oluşur. Bu TLR4 uyarmak için LPS kullanarak laboratuar ortamında çoğaltılır. Bu uyarımı upregulates NLRP3 ve NF-kB sinyal aracılığıyla pro-IL-1β. Ayrıca priming NLRP3 transkripsiyon mekanizmalar aracılığıyla onun deubiquitination9,10 ve fosforilasyon veya belirli artıkları11,12dephosphorylation inducing tarafından lisans verir.
İkinci sinyal NLRP3 harekete geçirmek için ne kadar zor8NLRP3 harekete geçirmek için birleştirici bir mekanizma kalır mitokondrial faktörler, reaktif oksijen türleri, potasyum sızma ve sinyal, kalsiyum içeren düşünülmektedir. Aktif NLRP3 onun NACHT etki alanları arasındaki etkileşimler yoluyla oligomerizes ve ASC pyrin (PYD) etki alanları13bağlama yolu ile acemi. Her hücre, tek bir mikroskobik görünür odak makromoleküllerin bu kompleksler oluşturur. ASC aslında insan lösemi hücreleri apoptosis sırasında bir "leke" oluşturan 22 KDa protein ve bir kart14içeren adlandırılmış apoptozis ile ilişkili leke gibi protein olarak tespit edilmiştir. Bu daha sonra ASC pro-caspase-1 inflammasome15şekillendirme kartı pro-caspase-1, ASC kartıyla etkileşimi aracılığıyla acemi belirlendi.
Tüm NLR'ler caspase-1 aktivasyon ikna etmek için ASC varlığını gerektirir. NLRP3, aksine NLRC4 ve NLRP1b kartı etki alanları var ve pro-caspase-1 caspase-1 aktivasyon ikna etmek için kart etkileşimleri aracılığıyla doğrudan işe. ASC yokluğunda active caspase-1 sitozol yaygın olarak kalır ve tek bir odak noktası formu değil. Bu yaygın active caspase-1 pyroptotic hücre ölümü ikna etmek yeterli ama pro-IL-1β13,16işleyemiyor.
Bu makale, inflammasome harekete geçirmek değerlendirmek için iki yol ele alınacak. İlk floresan faaliyet kullanan sonda, FAM-YVAD-caspase-1 proteaz ailesinin bağlayan FMK,. Bu aile caspase-1, ama aynı zamanda fare caspase-11 ve insan caspase-4 ve caspase-5 içerir. Caspase-1/11 eksik fare üzerinden makrofajlar tüm deneyler kullanarak, bu sonda özgüllük ele alınacaktır. Bu yöntem ayrıca anlatacağız inflammasome bileşenlerinin antikor etiketleme ile kombine edilebilir. Mikroskobik görselleştirme için tek tek hücreleri aktif caspase-1 ve oligomerized ASC içeren kimlik sağlar. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar inflammasome oluşumu cascade bir etkisi konak hücre veya altında eğitim patojen organizma kendi işlemler olduğu belirlemek mümkün olacak. Örneğin, belirli bir müdahale ASC alımı karmaşık NLRP3 engeller ya da sonraki işe alım ve caspase-117aktivasyonu hedefleyen bir ayırt edebilirsiniz. Caspase-1 etkinleştirme IL-1β salgı gibi sonuçlarını inceleyerek bu iki olasılık arasında ayırt etmek mümkün olmaz. Ayrıca, IL-1β salgı hücreleri yetenek caspase-1 etkinleştirmek ve pyroptotic hücre ölüm16geçmesi değiştirmeden değişmiş.
İkinci yöntem yukarıda açıklanan caspase-1 harekete geçirmek izleyip pyroptotic makrofaj lizis sırasında oluşan serbest bırakılması laktat dehidrogenaz (karaciğer) süpernatant, hücre içine ölçer. Tüm karaciğer sürümünde de ölçülen bu ikinci yöntem nüfus temelli bir yaklaşım olur. Bu basit yaklaşım hızlı analiz örnekleri için (kuluçka süresi 30 dk) caspase-1-aracılı hücre ölümü olup olmadığını belirlemek için izin verir ve bir 96-şey plaka biçimde gerçekleştirilebilir.
Bu yöntemleri tamamlayıcı, her biri farklı avantajları ve her ikisi de kolayca değişiklikler mükellef bulunmaktadır. Örneğin, makrofaj tedavi ile hedeflenen küçük molekül ağırlıklı bileşikler inflammasome stimülasyon önce rol proteinler inflamatuar yanıt-e doğru kontrol üzerinde olabilir belirli araştırmak için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-MEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>For growing L929 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCRC clone 929 (L929)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer.&#160; Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-G1780</td>
			<td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-YVAD-FMK</td>
			<td>Immunocytochemistry Technologies</td>
			<td>98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Heat inactivated at 55&#176;C for 50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p36934</td>
			<td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse ALEXA555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21051024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>far-red fluorescent nucleic acid stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratoy</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-1/11-/- mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>016621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8X Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td>
			<td>List Biologicals</td>
			<td>434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ASC clone 2EI-7</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>04-417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercapto-ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M3 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>5000414</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes birçok patojen organizmalar başarılı kontrolü için gerekli olan ama aynı zamanda inflamatuar teşvik doğuştan gelen bağışıklık sinyal gönderme platformları ve otoinflamatuvar hastalıklar vardır. Inflammasomes başını sallamak-benzeri reseptör (NLR) aile üyeleri de dahil olmak üzere sitozolik desen tanıma reseptörleri tarafından aktif hale gelir. Bu reseptörler mikrobiyal veya hasar ilişkili uyarinin algılama oligomerize. Sonraki artan adaptör protein alımı caspase-1 ile yakınlık kaynaklı auto-harekete geçirmek harekete geçirmek bir mikroskobik görünür inflammasome karmaşık, oluşturur. Harekete geçirmek, caspase-1 pro-IL-1β ve pro-IL-18, harekete geçirmek ve bu pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını lider cleaves. Caspase-1 Ayrıca inflamatuar formdaki membran bütünlüğü ve hücre lizis kaybı özellikleri pyroptosis olarak adlandırdığı hücre ölümü aracılık eder. Caspase-1 gasdermin için ozmotik lizis önde gelen D, plazma zarı gözenekleri, oluşturan N-terminal parça bırakmadan cleaves.
İçinde vitro, belgili tanımlık harekete geçirmek caspase-1 caspase-1 faaliyet sonda FAM-YVAD-FMK ile kemik iliği türevi makrofajlar etiketleme ve adaptör protein ASC karşı antikor hücrelerle etiketleme belirlenebilir. Bu teknik inflammasome oluşumu ve caspase-1 harekete geçirmek floresans mikroskobu kullanarak tek tek hücreleri içinde kimliği sağlar. Pyroptotic hücre ölümü Orta serbest bırakılması sitozolik laktat dehidrogenaz ölçüm tarafından tespit edilebilir. Bu basit, uygun maliyetli ve filtreleme için uyum sağlayan bir 96-şey plaka biçiminde gerçekleştirilen işlemdir. Bu makale, nigericin tarafından NLRP3 inflammasome aktivasyonu için adaptör protein ASC ve etkin caspase-1, yerelleştirme iş açar pyroptosis için önde gelen gösteriyoruz.

Caspase-1 harekete geçirmek nigericin maruz takip algılamak için hücreleri Protokolü bölümünde açıklandığı gibi işlendi. FAM-YVAD-FMK ve ASC ASC ve etkin caspase-1 NLRP3-aracılı inflammasome harekete geçirmek takip işbirliği yerelleştirmek olduğunu göstermek için antikor etiketleme kombine. Şekil 1A 5 mikron nigericin maruz vahşi türü makrofajlar Perinükleer bölgede bir ASC odak oluşumu olduğunu gösterir. Bu resimde de ASC FAM-...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K Görüntüleme.  University of Washington. NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Video: Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...