Name: detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages at JoVE.com

Alle Mikroskopie erfolgte in der W. M. Keck Mikroskopie Mitte mit Unterstützung von Nathaniel Peters und mit Unterstützung des NIH Award S10OD016240. S.L.F. wird von NIH K08AI119142 und R21AI130281 unterstützt. Wir danken Dr. Richard Flavell und Dr. Brad Cookson Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse und Dr. Brad Cookson für den Austausch von Laboreinrichtungen und Geräte.

Alle tierische Verfahren geprüft und bei der Universität von Washington institutionelle Animal Care und Use Committee Richtlinien durchgeführt.
(1) die Ernte des Knochenmarks
<ol><li>Aseptisch Femur und Tibia aus einer Maus herausnehmen und Reinigen der Knochen mit sterilen Instrumenten. Legen Sie die gereinigten Knochen in Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamicin Sulfat + 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin + 10 % fetalen bovine Serum (FBS, DMEM-10 komplette) und inkubieren Sie die Rohr für 15 min auf Eis.</li>
	<li>Entfernen Sie die proximalen und distalen Kugelgelenke mit einer Schere. Nadel 25 G an eine 10 mL Spritze gefüllt mit Medium in den Hohlraum der Knochen befestigt. Spülen Sie das Knochenmark mit DMEM-10 abgeschlossen. Aufzuwirbeln Sie jeder Klumpen durch das Medium sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Die Zellen für 10 min bei 300 X g zentrifugieren und die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. An dieser Stelle entweder Einfrieren der Zellen mit 90 % FBS + 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Platte Zellen in einem 15 cm Petrischale Makrophagen mit L929 konditioniert Medium (Schritt 2.1) zu unterscheiden.</li>
</ol>(2) Differenzierung von Makrophagen Knochenmark abgeleitet
<ol><li>Verwenden vorgewärmte Differenzierung Medium (21 mL DMEM-10 abgeschlossen und L929 Zellen bedingt Medium wie von Swanson Et Al. beschrieben 9 mL ( 18), habe Knochenmarkzellen in einem 15 cm nicht Gewebekultur Petrischale (1,2-1,5 x 107 Zellen) behandelt. 7 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 . Fügen Sie eine zusätzliche 30 mL Differenzierung Medium auf den Teller am Tag 3 oder 4. Hinweis: Es ist wichtig nicht zu Gewebekultur behandelt Platten verwenden wie Makrophagen schwierig werden zu lösen und zu ernten.</li>
	<li>Makrophagen zu sammeln, waschen Sie die Platte mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 20 mL kaltem PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Brüten Sie der Platte bei 4 ° C für 10 min. Ernte der Zellen durch pipettieren der PBS + EDTA über die Zellen und waschen Sie die Platte mit 10 mL PBS. Kombinieren Sie beide Waschgänge in zwei 15 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Die Zellen bei 300 X g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL von Phenol-rot frei DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 5 % FBS (DMEM-5) und die Zellen, die entweder ein Hemocytometer oder ein Coulter Counter zählen. Halten Sie die Zellen auf dem Eis während der Auszählung.</li>
	<li>Samen der Makrophagen in Gewebekultur beschichtete Platten 2 x 105 Zellen/ml. Samen Sie für Mikroskopie-Experimente 1 mL der Zellen auf Deckgläsern in 24-well-Platten. Samen Sie für LDH Release Assays 100 µL der Zellen in einer 96-well-Platte. Samen Sie für die LDH-Assay 9 Brunnen (3 Brunnen unbehandelt, 3 Brunnen mit 100 % Lyse Kontrollen und 3 Brunnen für den experimentellen Stimulus).</li>
	<li>Zentrifugieren der 96-well-Platte für 5 min bei 300 X g, stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig über die gut verteilt sind.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C + 5 % CO2 vor der Grundierung beginnen.</li>
</ol>3. grundieren
<ol><li>Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium (DMEM-5) mit 100 ng/mL LPS (500 μL für die 24 gut Platte oder 50 μL für die 96 gut Platte). Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von strukturellen Variationen in LPS, die Einfluss auf die Fähigkeit, TLR4-vermittelten Priming19zu stimulieren. LPS von Salmonella Minnesota R595 (Re) ist von mehreren Herstellern erhältlich und wird empfohlen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
</ol>(4) Aktivierung des NLRP3-Inflammasome mit Nigericin und Etikettierung mit FAM-YVAD-FMK
<ol><li>Entfernen Sie das Medium zu und ersetzen Sie es mit 290 μL DMEM-5, 5 μM Nigericin und 5 mM Glycin enthält. Glycin wird hinzugefügt, um die Reduzierung der Lyse der Zelle bei der Aktivierung von Caspase-15. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren. Verwenden Sie Wildtyp und Caspase-1 mangelhafte Makrophagen, um sicherzustellen, dass die beobachteten Beschriftung spezifisch für Caspase-1 ist.</li>
	<li>Während die letzten 45 min hinzufügen 10 μL 30 x FAM-YVAD-FMK, zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 60 min das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL von 2 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung und auf Eis bedeckt mit Alu-Folie für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie während der letzten 5 min 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck um die Kerne zu beschriften. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder andere Farbstoffe können auch Label DNA verwendet werden.</li>
	<li>Die Zellen dreimal mit 1 mL kaltem PBS waschen und Deckgläsern auf Objektträger mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmittel zu montieren. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit Nagellack Härten.</li>
	<li>Bild der Makrophagen durch konfokale Mikroskopie. Ex / Em für FAM-YVAD-FMK ist 492/520nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure-Fleck. Achten Sie darauf, das Mikroskop einrichten, so dass unbehandelte Zellen nicht jeden beliebigen Hintergrund Färbung in den 488 Kanal angezeigt werden. Andernfalls wird die Hintergrundfärbung FAM-YVAD-FMK erkannt und nicht die tatsächliche aktive Caspase-1 sein. Hinweis: Mikroskop-Set-up ist in Abschnitt 6 beschrieben.</li>
</ol>5. Antikörper Färbung
Hinweis: Um die Zellen mit Antikörpern gegen ASC erkennen zu beschriften, Saatgut, prime und setzen Sie die Zellen, die Nigericin identisch mit dem vorherigen Abschnitt. Die Verarbeitung ist danach wie folgt:
<ol><li>Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS. Fügen Sie 250 μL der Fixierung und Permeabilisierung Lösung. Brüten die Zellen auf Eis, und für 30 min abgedeckt.</li>
	<li>Waschen Sie die Makrophagen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL der Waschpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μl Primärantikörper gegen ASC 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Gehören Sie ein deckgläschen, der erhält keiner primären Antikörper, sondern erhält nur die sekundäre. Das Deckglas wird während des Setups Mikroskop verwendet werden, um den richtigen Abstand vom Koordinatenursprung.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL Waschpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL der Sekundärantikörper (Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Ziege-Anti-Maus) 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Label-Kerne 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck für die letzten 5 min diese Inkubation hinzufügen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL kalte Waschpuffer und Mount Deckgläsern auf Mikroskop Folien mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmedium. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit klaren Nagellack Härten.</li>
	<li>Bild Makrophagen konfokalen Mikroskopie. Ex / Em für den sekundären Antikörper ist 555/580 nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck (wie unten beschrieben). Hinweis: Mit FAM-YVAD-FMK und Antikörper Beschriftung Beschriftung kann kombiniert werden um Co Lokalisierung von aktive Caspase-1 und ASC zeigen. Hierzu folgen Sie die Bedingungen für die FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und wechseln Sie dann in der Antikörper labeling Protokoll zur weiteren Verarbeitung.</li>
</ol>6. Bildgebung von beschrifteten Makrophagen durch konfokale Mikroskopie
Hinweis: Die gefärbten Zellen können nach der Deckgläsern erlaubt haben, über Nacht zu heilen und wurde auf dem Objektträger mit Nagellack versiegelt angesehen werden. Hier ist die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop beschrieben. Zellen können auch durch standard Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.
<ol><li>Legen Sie die Folie mit den unbehandelten Zellen auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Zellen zu.</li>
	<li>Das Mikroskop Look Up Table (LUT) einstellen Einstellungen, Versatz, so dass es keine positiven FAM-YVAD-FMK Färbung in den unbehandelten Zellen. Dieser Vorgang kann auch mit mangelhaft Makrophagen Caspase-1 durchgeführt werden. Hinweis: Der Offset hat für jeden Kanal in das Experiment verwendet angepasst werden, aber einstellen den korrekten Offset ist kritischste für die FAM-YVAD-FMK Kanal und fluoreszierende Antikörper Kanäle. Der Offset für die DNA-Kanal ist weniger kritisch. Sobald der Offset festgelegt wurde, stellen Sie diese Einstellung für den Rest des Experiments nicht.</li>
	<li>Wechseln Sie die Folie zum Beispiel Nigericin behandelt. Finden Sie ein Feld, beide Zellen, die positiv und negativ enthält für die FAM-YVAD-FMK Färbung sind. Passen Sie die Abbildungsebene des FAM-YVAD-FMK Kanals auf das Flugzeug, das die höchste Intensität der positive Färbung hat. Normalerweise werden dies im Flugzeug, wo das Zentrum des Inflammasome Fokus abgebildet ist.</li>
	<li>Passen Sie die Verstärkung so dass Brennpunkte in den Zellen sichtbar sind, die verdichteten Kerne haben. Lassen Sie nach der Einstellung von Gain und Offset diese Einstellungen für den Rest der bildgebenden Sitzung. Hinweis: Eine einfache Möglichkeit, festzustellen, ob eine Zelle Pyroptotic ist durch das nukleare Morphologie betrachten. Zellen mit aktiven Caspase-1 haben abgerundete und verdichteten Kerne, während nukleolen in Zellen ohne Aktivierung der Caspase-1 und die nukleare Morphologie sichtbar sind ist ähnlich denen von unbehandelten Zellen.</li>
	<li>Sammeln Sie Bilder von 5 zufällig ausgewählten Felder bei 100 X Gesamtvergrößerung. Dies führt normalerweise ca. 40 Zellen pro Bild. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe.</li>
	<li>Die Anzahl der Zellen in jedem Bild mit Bildanalyse-Software. Dann die Anzahl der Zellen, die positive FAM-YVAD-FMK Färbung haben. Vertreten Sie die Aktivierung der Caspase-1 als der Anteil der FAM-YVAD-FMK positive Zellen.</li>
</ol>(7) LDH-Release-Assay
Hinweis: Für die LDH-Release-Assay verwenden Saatgut und Prime, was die Zellen wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, außer einer 96-well-Platte. Entfernen Sie das Medium nicht nach dem grundieren.
<ol><li>Fügen Sie 50 μL DMEM-5 mit 10 μM Nigericin in die experimentelle Vertiefungen und 50 μL DMEM-5, die spontanen und 100 % Lyse-Kontroll-Vertiefungen. Fügen Sie keine Glycin in diesem Experiment, da die Zelle Lysis messen soll. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Nach 30 min 10 μl 10 X Lyse Puffer zu 100 % Lyse Kontroll-Vertiefungen und fügen Sie 10 μL DMEM-5 hinzu, die weiteren Bohrungen. Während diese Inkubation 1 Durchstechflasche Substrat-Mix (1,5 mL gefriergetrocknete Substrat) und 1 aliquoten testpuffer (~ 12 mL) aus der Tiefkühltruhe zu entfernen und lichtgeschützt auf Zimmertemperatur auftauen lassen. Hinweis: Die Substrat-Mischung enthält eine Tetrazolium Salz (Iodonitro-tetrazoliumsalz violett), die zu einem roten Formazan Produkt umgewandelt wird.</li>
	<li>Nach insgesamt 60 min Inkubation Zentrifugieren der Platte für 5 min bei 500 X g bei 10 ° C. Übertragen Sie 50 μl des Überstands auf eine klare flach-Boden-Platte. Während dieser Zeit das Fläschchen des Substrat-Mix 12 mL testpuffer hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min vor der Verwendung.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL des Substrats in jede Vertiefung und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Enthalten Sie mittlere nur Brunnen für leere Werte. Überprüfen Sie die Platte nach 15 min um sicherzustellen, dass das Signal die Nachweisgrenze des Lesers Platte nicht überschreiten wird.</li>
	<li>Fügen Sie nach 30 min 50 μL Stopp-Lösung (1 M Essigsäure hinzu) und Messen Sie OD490 mit einem Teller-Reader.</li>
	<li>Berechnen Sie den Anteil der Lyse der Zelle mit Hilfe der folgenden Formel: % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maximale-spontane)) × 100 Experimentelle: Nigericin behandelt Zellen; spontane: unbehandelten Zellen; maximal: Zellen, Lyse-Puffer</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen

In dieser Handschrift haben wir zwei Techniken untersuchen Inflammasome Aktivierung und die Folge der Aktivierung der Caspase-1 nach NLRP3 Stimulation in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet vorgestellt. Die erste Technik ermöglicht den Forscher, die Aktivierung der Caspase-1 auf einer zellulären Basis mit fluoreszierenden Reporter FAM-YVAD-FMK bestimmen. Dieser Reporter ist hochspezifisch für die Bindung der Caspase-1-Familie von Enzymen, wie durch das Fehlen der Färbung in Caspase-1/11 mangelhaft Makrophagen ...

Inflammasome-vermittelte Entzündung zugrunde liegt auch die Ursache von vielen Krankheiten2ist ein wesentlicher Bestandteil der Abwehr pathogener Organismen1 Die entzündliche Reaktion auf eine Vielzahl von Infektionen ausgelöst durch cytosolische Nachweis des Erregers verbunden molekulare Muster (PAMPs) oder Schäden verbunden molekulare Muster (DAMPs). Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRR), einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder oligomerize auf den Nachweis dieser PAMPs und DAMPs. Dies löst die Bildung eines Multi-Protein-Komplex bezeichnet die Inflammasome, die die PRR, Adapter Protein Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein mit einer C-terminalen Caspase Recruitment Domain (Karte) (ASC) und pro-Form enthält Caspase-13,4. Diese Anlage ermöglicht Nähe-induzierte Auto-Aktivierung von Caspase-1. Aktive Caspase-1 führt dann zu einer Reihe von Ereignissen, die charakteristisch für die entzündliche Zelle Tod Weg Pyroptosis. Zu diesen Ereignissen gehören: die Spaltung und die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-18, Lysosomen Exozytose mit Freisetzung von lysosomalen Inhalts in den Extrazellulärraum, nukleare Kondensation und Gasdermin D Dekolleté. Die freigesetzte N-terminale Domäne des Gasdermin D fügt in der Plasmamembran, Bildung von Poren, die dazu führen, dass die Plasmamembran Bruch und Freisetzung von entzündlichen Inhalt, zusätzlich eine schützende Nische für Erreger Replikation5, wegnehmen 6 , 7.
Hier konzentrieren wir uns auf den gut untersuchten NLRP3-Inflammasome. Die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome erfolgt durch einen zweistufigen Prozess8. Der erste "Priming" Schritt erfolgt durch die Anerkennung von Toll-Like-Rezeptoren (TLR) eines mikrobiellen Produkts. Dies wird in der Laborumgebung repliziert, mithilfe von LPS, um TLR4 zu stimulieren. Diese Stimulation reguliert NLRP3 und Pro-IL-1β durch NF-κB-Signalisierung. Grundierung zusätzlich Lizenzen NLRP3 durch nicht-transcriptional Mechanismen durch Induktion der Deubiquitination9,10 und Phosphorylierung oder Dephosphorylation bestimmte Rückstände11,12.
Das zweite Signal für NLRP3 Aktivierung wird gedacht, um mitochondrialen Faktoren, reaktive Sauerstoffspezies, Kalium Ausfluss und Kalzium-Signalisierung, beinhalten ein einheitlicher Mechanismus für NLRP3 Aktivierung schwer fassbaren8bleibt. Aktivierte NLRP3 durch Interaktionen zwischen seinen NACHT-Domains oligomerizes und ASC über Bindung von Pyrin (PYD) Domänen13Rekruten. In jeder Zelle bilden diese makromolekulare Komplexe einen einzigen mikroskopisch sichtbaren Fokus. ASC wurde ursprünglich als ein 22 KDa-Protein, das einen "Fleck" während der Apoptose von menschlichen Leukämie-Zellen bildet und benannte Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein enthält eine Karte14identifiziert. Es wurde später festgestellt, dass ASC Pro-Caspase-1 durch das Zusammenspiel der Karte des ASC mit der Karte von Pro-Caspase-1, bilden die Inflammasome15Rekruten.
Nicht alle NLRs erfordern das Vorhandensein der ASC induzieren Caspase-1 Aktivierung. Im Gegensatz zu NLRP3 NLRC4 und NLRP1b Karte Domänen und Pro-Caspase-1 über Karte Interaktionen induzieren Caspase-1 Aktivierung direkt einstellen können. In Ermangelung von ASC aktive Caspase-1 bleibt diffus in die Zellflüssigkeit und bildet keinen einzigen Fokus. Diese diffuse aktive Caspase-1 ist ausreichend, um Pyroptotic Zelltod induzieren, aber ist nicht in der Lage, Pro-IL-1β13,16zu verarbeiten.
In diesem Manuskript besprechen wir zwei Möglichkeiten zur Aktivierung der Inflammasome zu beurteilen. Die erste verwendet die fluoreszierende Aktivität Sonde, FAM-YVAD-FMK, die die Caspase-1-Familie von Proteasen bindet. Diese Familie umfasst Caspase-1, aber auch Maus Caspase-11 und menschlichen Caspase-4 und Caspase-5. Makrophagen von Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse in allen Experimenten verwenden, wird die Spezifität dieser Sonde angesprochen werden. Diese Methode kann kombiniert werden mit Antikörper Kennzeichnung von Inflammasome Komponenten, die wir auch beschreiben. Mikroskopische Visualisierung ermöglicht die Identifizierung von einzelnen Zellen, die aktive Caspase-1 und oligomerized ASC. Forscher werden mit dieser Methode feststellen, wo in der Inflammasome-Bildung-Kaskade ihren Manipulationen der Wirtszelle oder pathogener Organismus unter Studie auswirken. Zum Beispiel kann man unterscheiden, ob eine bestimmte Intervention verhindert, die Rekrutierung von ASC, komplexe NLRP3 dass oder richtet sich an die nachfolgenden Rekrutierung und Aktivierung von Caspase-117. Ergebnisse der Caspase-1 Aktivierung wie IL-1β-Sekretion zu prüfen wäre nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden. Auch, könnte die Sekretion von IL-1β geändert werden, ohne dass die Fähigkeit der Zellen zur Aktivierung der Caspase-1 und Pyroptotic Zelle Tod16zu unterziehen.
Die zweite Methode misst die Freisetzung von Laktat-Dehydrogenase (LDH) in die Zelle überstand, die auftritt, während Pyroptotic Makrophagen Lyse nach Aktivierung der Caspase-1, wie oben beschrieben. Diese zweite Methode ist eine bevölkerungsbezogene Ansatz wie die Freisetzung von LDH im gesamten gut gemessen wird. Dieser einfache Ansatz ermöglicht die schnelle Analyse von Proben (30 min Inkubation Zeit) um festzustellen, ob es Caspase-1-vermittelte Zelltod gibt und kann in einem 96-Well-Plattenformat durchgeführt werden.
Diese Methoden sind komplementär, jeweils mit verschiedenen Vorteilen, und beide sind Modifikationen leicht zugänglich. Beispielsweise kann Makrophagen Behandlung mit gezielten kleinen Molekulargewicht Verbindungen vor Inflammasome Stimulation verwendet werden, untersuchen die Rolle sicher, dass Proteine auf Entzündungsreaktionen Steuern haben können.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>For growing L929 cells</td></tr><tr><td>NCRC clone 929 (L929)</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, no glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS, no calcium, no magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Heat inactivated at 55&amp;deg;C for 50 min</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mounting Medium</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td></tr><tr><td>goat anti-mouse ALEXA555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>far-red fluorescent nucleic acid stain</td></tr><tr><td>C57BL/6J mouse</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>caspase-1/11-/- mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8X Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>anti-ASC clone 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercapto-ethanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M3 plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes sind angeborene immun Signalisierung Plattformen, die für die erfolgreiche Bekämpfung vieler pathogenen Organismen sind erforderlich, sondern auch fördern entzündliche und Autoimmun-Krankheiten. Inflammasomes werden durch cytosolische Muster Anerkennung Rezeptoren, einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder aktiviert. Diese Rezeptoren oligomerize auf den Nachweis der mikrobiellen oder Schäden verbundenen Reize. Nachträgliche Einstellung des Adapter-Proteins ASC bildet eine mikroskopisch sichtbaren Inflammasome Komplex, die Caspase-1 durch Nähe-induzierte Auto-Aktivierung aktiviert. Nach der Aktivierung spaltet Caspase-1 Pro-IL-1β und Pro-IL-18, zur Aktivierung und Sekretion dieser Pro-inflammatorische Zytokine. Caspase-1 vermittelt auch entzündliche Form des Zelltods bezeichnet Pyroptosis, verfügt über den Verlust der Membran Integrität und Zell-Lyse. Caspase-1 spaltet Gasdermin D, die N-terminale Fragment, das Plasmamembran Poren bildet die Freigabe zu osmotische Lyse.
In Vitro, die Aktivierung von Caspase-1 kann durch Knochenmark stammenden Makrophagen mit der Caspase-1 Aktivität Sonde FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und Etikettierung der Zellen mit Antikörpern gegen das Adapter-Protein ASC ermittelt werden. Diese Technik ermöglicht die Identifikation von Inflammasome Bildung und Aktivierung der Caspase-1 in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Pyroptotic Zelltod kann durch Messung der Veröffentlichung der cytosolischen Laktat-Dehydrogenase in das Medium erkannt werden. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und in einer 96-Well-Platte-Format, so dass die Anpassung für das Screening durchgeführt. In dieser Handschrift zeigen wir, dass die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome von Nigericin bis zur Co Lokalisierung der Adapter Protein ASC und aktive Caspase-1, führt zu Pyroptosis.

Um Caspase-1 Aktivierung nach der Exposition gegenüber Nigericin zu erkennen, wurden die Zellen verarbeitet, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Wir kombinierten FAM-YVAD-FMK und ASC Etikettieren Antikörper um zu zeigen, dass ASC und aktive Caspase-1 Co lokalisieren nach Aktivierung des NLRP3-vermittelten Inflammasome. Abbildung 1A zeigt, dass Wildtyp Makrophagen ausgesetzt 5 μM Nigericin Bildung von einer ASC-Fokus in der perinukleären Region. Diese ...

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Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K Aufrufe.  University of Washington. Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Serie: Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development and implementation of biomedical devices and tissue engineering constructs. Macrophages, an innate immune cell, are key players in the foreign body reaction because they remain at the implant site for the lifetime of the device, and are commonly studied to gain an understanding of this detrimental host response. Many biomaterials researchers have shown that adsorbed protein layers on implanted materials influence macrophage behavior, and subsequently impact the host response. The methods in this paper describe an in vitro model using adsorbed protein layers containing cellular damage molecules on polymer biomaterial surfaces to assess macrophage responses. An NF-&#1082;B/AP-1 reporter macrophage cell line and the associated colorimetric alkaline phosphatase assay were used as a rapid method to indirectly examine NF-&#1082;B/AP-1 transcription factor activity in response to complex adsorbed protein layers containing blood proteins and damage-associated molecular patterns, as a model of the complex adsorbed protein layers formed on biomaterial surfaces in vivo.

This protocol provides researchers with a rapid, indirect method of measuring TLR-dependent NF-&#1082;B/AP-1 transcription factor activity in a murine macrophage cell line in response to a variety of polymeric surfaces and adsorbed protein layers that model the biomaterial implant microenvironment.

Ein Makrophagen-Reporter-Zell-Assay zur Untersuchung der toll-like Receptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalisierung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

Biotechnik

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

Aktivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark der Maus als Reaktion auf Antikörper

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Host Defense Mechanism

Detection of Inflammasome Activation via Fluorescence Microscopy

Source: den Hartigh, A. B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video demonstrates a method to detect NLRP3 inflammasome activation in macrophages using fluorescent reporter probes. The cells are treated with potassium ionophores and glycine to induce inflammasome assembly and caspase-1 activation. Fluorescent reporter probes visualize activated caspase-1, and cells are stained with a fluorescent dye for nuclei visualization.

Nachweis der Inflammasomaktivierung mittels Fluoreszenzmikroskopie

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

An In Vitro Technique to Study Inflammasome Complex Formation in Macrophages

Source: den Hartigh, A. B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique to study NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome formation in primary macrophages via immunofluorescence. The macrophages are first primed with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to upregulate NLRP3 protein expression. Exposing the macrophages to nigericin&#8212;a potassium ionophore&#8212;leads to the activation of NLRP3 and the formation of inflammasomes, which are visualized via immunofluorescence.

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der Bildung von Inflammasom-Komplexen in Makrophagen

A Lactate Dehydrogenase Release Assay To Detect Macrophage Death Following Nigericin Exposure

Source: den Hartigh, A.B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57463">Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the lactate dehydrogenase assay to detect inflammasome-mediated macrophage death. The macrophages are exposed to lipopolysaccharide for priming, followed by exposure to nigericin to cause inflammasome-induced cell death, which is determined by the lactate dehydrogenase assay.

Ein Laktat-Dehydrogenase-Freisetzungsassay zum Nachweis des Todes von Makrophagen nach Nigericin-Exposition

1. LDH Release Assay
NOTE: For the LDH release assay, seed the cells in a 96-well plate. Do not remove the medium after priming.

	Replace the medium with ...