Biz Rebecca Williams ve Cornell BRC görüntüleme Johanna Dela Cruz ve Andrew Recknagel yararlı öneriler ve teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık grant Enstitüleri için desteklenen S10-OD018516 (için Cornell tesis görüntüleme), T32HD057854 J.C.B. için ve R01-GM45415 J.C.S. için

Cornell Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) burada, JCS iletişim kuralına 2004-0038 altında açıklanan tüm yöntemleri onayladı.
1. hazırlanması kültür ortam ve aygıtlar
<ol><li>Çalışma alanı % 10 çamaşır suyu ile temiz ve en az 5 min için çalışma alanı yüzeyinde kalır çamaşır suyu izin silin. 5 dk sonra fazla çamaşır suyu temiz kağıt havlu ve % 70 etanol (alkol) ile kaldırın. % 70 ile iyice diseksiyon mikroskop temiz alkol. Not: Bu çalışma alanının en az yarı steril organ kültürlerin kirlenmesini önlemek için önemlidir.</li>
	<li>Şal temiz forseps ve makas % 70 ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu ile alkol kullanım zaman kadar. Not: İdeal diseksiyon araçları yumurtalık yaş/boyutuna göre değişebilir. En iyi sonuçları bir mikro keskin diseksiyon makas, iki iyi ipucu forseps (ya sayı 5 veya 55) kullanarak elde edilir ve bir mikro Iris makas anatomi.</li>
	<li>Konik bir tüp içinde 50 mL yumurtalık kültür medya ve sıcak bir 37 ° C su banyosu içinde olun.<ol>
<li>Yumurtalık kültür orta4yapmak için en az temel medya (MEM) ile %10 Fetal sığır Serum (FBS), 25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 100 adet/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 0,25 µg/mL x 1 ek Amfoterisin B (Örneğin, MEM, 45 mL 5 mL ısı de inaktive FBS, HEPES 1,25 mL ve penisilin, streptomisin ve Amfoterisin B 100 x stokunun 0.5 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaplamalar ve ekler yumurtalık kültür önce hazırlayın.<ol>
<li>Bir doku kültürü başlık, bir 35 mm doku kültürü plakasına yumurtalık kültür orta 1 mL ekleyin.</li>
		<li>INSERT membran kültür orta ile önceden ıslatın. Genellikle 0.55 mL başına, 24 iyi taşıyıcı doku kültürü levha ve yer bir hücre kültürü eklemek kuyuda yeterli miktarda ortam ekleyin. Medya Ekle'nın membran dokunur emin olun.</li>
		<li>35 mm plakalar ve wells ile hücre kültür ekler yumurtalık deneyinde beklenen sayısına göre hazırlayın. Kültür medya ve kültür medya ve 37 ° C, % 5 CO2ve atmosferik O2 kuluçka ekler içeren 24-iyi taşıyıcı plaka 1 mL içeren 35 mm tabak koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sıcak bir tabak diseksiyon kapsamın yanındaki düzenlemek ve 37 ° c sıcaklık ayarla Bir 37 ° C, % 5 CO2 tutun ve atmosferik O2 kuluçka diseksiyon oda yakın.</li>
</ol>2. yumurtalık diseksiyon ve Organ kültür
Not: Sigara-ideal sıcaklık maruz en az olduğu sürece yumurtalık oda sıcaklığında disseke.
<ol><li>Doğum sonrası gündüzleri 5, işten çıkarma, teker teker, dişi fareler ötenazi. Not: Ötenazi araştırma gerçekleştirildiği tesiste mevcut IACUC kurallarına göre yapılmalıdır.</li>
	<li>Hayvan % 70 ile sprey alkol. Hayvan diseksiyon mikroskop altında kuru kağıt havlu üzerine yerleştirin. Yumurtalık kültür ortamı diseksiyon mikroskop yakın içeren bir 35 mm doku kültürü tabak yerleştirin.</li>
	<li>Forseps veya mikro diseksiyon Iris makas ile bağırsak kesmemeye dikkat kullanarak bir kesik deri yoluyla hayvan ve karın boşluğu içine olun. Bağırsak karın boşluğu dışarı itmek ve yumurtalıklar bulun. Yumurtalık ayıklamak ve kültür ortamı içeren 35-mm doku kültürü çanak içine koyun.</li>
	<li>Sonra yumurtalık hayvandan disseke, yumurtalıklar ve ekli herhangi bir doku daha iyi görmek için diseksiyon mikroskop büyütme artırın. İle iyi ipucu forseps temiz, tüm olmayan yumurtalık dokusu, bursa ve yağ dokusu gibi kaldırın. Yumurtalık ne zaman ekli olmayan yumurtalık dokusunu korumak için dikkatli olun.</li>
	<li>Yumurtalık izole olduğunda, çift taşıyıcı 24-şey plaka öncesi hücre kültür ekler yerleştirin (Adım 1.4.2 ve 1.4.3 bakın) ve organ nemli tutmak için yeterli olduğundan emin olmak için orta ses seviyesini (olmadan tamamen Bu batış). Dikkat: hücre kültürü Ekle membran bir delik yumurtalık aktarırken poke değil dikkatli olun.</li>
	<li>Yer organları 37 ° C, % 5 CO2ve atmosferik O2 kuluçka explanted.</li>
	<li>2.1-2.6 her hayvan yumurtalık disseke kadar hücre kültürü üzerinde yerleştirilen yumurtalık kültür ortamı içeren 24-şey Montaj levhası adımları yineleyin.</li>
	<li>Değişiklik yumurtalık kültür orta 2 günde kullanarak Over medya aliquots 37 ° C su banyosundan ısıttı ve Bölüm 3 istenen deneysel zamanda noktada protokolünün geçin.</li>
</ol>3. doku fiksasyon
<ol><li>%4 paraformaldehyde (PFA) 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 15 mL konik tüp hazırlayın (Örneğin, Ekle % 16 PFA elektron mikroskobu grade 2 mL 1 x PBS için 6 mL). Dikkat: PFA tehlikeli bir maddedir ve kimyasal bir başlık altında ele alınmalıdır.</li>
	<li>Kültürlü yumurtalık dokusu ile taze hazırlanmış % 4 İngiltere'de yılın çözüm kapsayan tarafından gelen Kültür Ekle, doku çıkarmadan düzeltmek. (Buharlaşma) önlemek için plastik yapıştırıcı ile plaka kenarlarını kapatın ve örnekleri gecede 4 ° C'de yer. Not: kullanım ve doku bütünlüğü kolaylaştırmak amacıyla, yumurtalıklar üzerinden hücre kültür Ekle bütün prosedür boyunca yerinden kaçının. Kültürlü yumurtalık ekleme yüzeye bağlı işleme için avantajlı zarar veya organ kaybetme olmadan.</li>
	<li>3 doku durulama x % 70 ile alkol ve ya 4.1 veya mağaza içinde mercek şişeleri dolu ile adım geçin % 70 alkol kadar 4 ° C'de daha fazla işleme. Not: Eğer doku endogenously kullanarak floresan protein, % 70 örnekleriyle depolama ifade alkol büyük ölçüde sinyali azaltabilir. Alternatif olarak, doku durulanır ve PBS ile % 0,2 sodyum azid (NaN3) saklanır. NaN3 olduğunu, ancak, çok zehirli ve ciddi solunum yolu tehlike teşkil etmektedir. Hisse senedi çözüm duman mahallede olun ve uygun kişisel koruyucu ekipman gibi bir laboratuvar mont ve nitril eldiven giyiyor kolu.</li>
</ol>4. bütün Dağı ayirt
<ol><li>4 h permeabilization adım 4.3 önce en az 1 x PBS RT, sabit doku yerleştirin.</li>
	<li>Permeabilization çözüm ve engelleme çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Permeabilization çözüm açıklandığı şekilde hazırlayın. 1 x PBS için % 0,2 polivinil alkol (PVA), % 0,1 sodyum borhidrür (NaBH4) çözümden (14 M sodyum hidroksit (NaOH) çözüm içinde 12 wt.%) ve % 1.5 polietilen glikol tert -octylphenyl eter (iyonik olmayan yüzey aktif deterjan) ekleyin. 50 mL konik tüp 10 PBS x 5 mL, PVA, NaBH450 µL ve iyonik olmayan yüzey aktif deterjan 750 µL 0.1 g ekleyin, sonra ultrasaf ekleyin ilâ 50 mL su ve karışım tamamen çözümünde olana de oda sıcaklığında kışkırtmak.</li>
		<li>Engelleme çözüm açıklandığı şekilde hazırlayın. 1 x PBS, % 0,1 iyonik olmayan yüzey aktif deterjan, %0,15 2.5 M glisin pH 7.4 eklemek için % 10 normal keçi serum, % 3 sığır serum albumin (BSA), %0,2 NaN3, 100 adet/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL Amfoterisin B. stok çözeltisi hazırlamak 2.5 glisin ultrasaf su için bir 500 mL son hacim (pH 7,4) 93.8 g ve % 10 NaN3 hisse senedi bir çözüm ultrasaf su 50 ml 5 g çözülerek eriterek tarafından M glisin; sonra bir 50 mL konik tüp içinde 10 x PBS, 50 µL iyonik olmayan yüzey aktif deterjan, 750 µL glisin hisse senedi çözüm, keçi serum, BSA, 1.5 g NaN3 hisse senedi çözüm 1 mL 5 mL 5 mL ekleyerek engelleme çözüm hazırlamak ve penisilin, streptomisin ve Amfoterisin B 100 x stokunun 0.5 mL. 50 mL ve şırınga filtre son hacmi kadar ultrasaf su nihai çözüm ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kaldırın ve 1 x PBS şişeyi üzerinden atmak ve sonra yumurtalık tamamen batırmak için yeterli permeabilization çözüm ekleyin. Örnek permeabilization çözüm üzerinde bir orbital Çalkalayıcı (Örneğin, nutator) oda sıcaklığında 4 h için yerleştirin. Not: Kuluçka zaman organ kalınlığı göre değişebilir.</li>
	<li>Permeabilization çözüm yumurtalıklar tamamen batırmak için yeterli engelleme bir çözüm ile değiştirin. Şişe plastik yapıştırıcı ile kapatın ve en az 12 h bir orbital Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında kuluçka doku bırakın.</li>
	<li>Başı olarak üreticinin veri sayfası engelleme çözümde birincil antikor seyreltme hazırlayın. : Not tüm antikorlar Temizleme Aracı ile uyumludur. Örnek gerekli ortalama hacmi yaklaşık 750 µL var.<ol>
<li>Oosit miktar için TAp63 kullanın (nükleer oosit marker) ve MVH (sitoplazmik germ hücre işaretçisi). Not: fare anti-p63 ve tavşan anti-MVH ayirt Albümdeki kullanılan antikor vardır). Birincil antikor eriyik-ebilmek var olmak yeniden kullanılan 2 x veya 4 ° C'de Protokoller boyama arasında saklanan ve bakteriyel büyüme önlemek için uygun şekilde yönetilmesini daha fazla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24-şey plaka dokusunda içeren INSERT yerleştirin ve yaklaşık 750 µL birincil antikor çözüm ekleyin. Yumurtalık tamamen batık emin olun. Buharlaşma en aza indirmek ve orbital Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 4 gün için kuluçka doku bırakmak için plastik yapıştırıcı ile plaka mühür.</li>
	<li>Yıkama çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Yıkama çözüm açıklandığı şekilde hazırlayın. 1 x PBS, olun % 0,2 PVA ve % 0.15 iyonik olmayan yüzey aktif deterjan ekleyin. 50 mL konik tüp 10 PBS x 5 mL, PVA 0.1 g, 75 µL iyonik olmayan yüzey aktif deterjan ve son hacmi 50 mL kadar ultrasaf su ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Birincil antikor seyreltme kaldırın ve yıkama çözüm bol miktarda ekleyin. Her zaman yumurtalık daldırın emin olun. Yumurtalık orbital Çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında gecede çözümde emmek izin.</li>
	<li>Yıkama çözüm yerini ve orbital Çalkalayıcı 2 saat veya daha fazla üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>4,9 adımı yineleyin bir ek süre.</li>
	<li>Çözüm kapatmaktır ikincil antikor seyreltme hazırlayın. Not: kullanılan ikincil antikorlar keçi ve keçi kaldırdı Anti-tavşan 594 floresan boya büyüdü Anti-fare 488 floresan boya vardır. Adım 4.5 bakın. ortalama birim için örnek gerekli.</li>
	<li>Yıkama çözüm yumurtalıklar kaldırın ve ikincil antikor çözüm ekleyin. Işık (alüminyum folyo ile sarma plaka) örnekleri korumak ve buharlaşma en aza indirmek için plastik yapıştırıcı ile plaka mühür. Oda sıcaklığında bir orbital Çalkalayıcı örnekleri için 2 gün kuluçkaya. Not: Alüminyum folyo sırasında tüm sonraki kuluçka adımları kullanarak ışık örnekleri korunmaya devam.</li>
	<li>İkincil antikor çözüm örnekleri kaldırın ve yıkama çözüm ekleyin. Orbital Çalkalayıcı 8 h için üzerinde kuluçkaya. Not: 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Boyama isterseniz, DAPI 50 ng/mL yıkama için ilk adım (~ 8 h kuluçka) ekleyin.</li>
	<li>Bir gecede yıkama yıkama çözüm değiştirin.</li>
	<li>Hazırlanırken takas çözüm (bakınız Bölüm 5), çözüm ile taze çözüm yıkama gecede değiştirin ve orbital Çalkalayıcı üzerinde örnekleri oda sıcaklığında tutmak.</li>
</ol>5. yumurtalık temizlenmesi ve görüntüleme
<ol><li>ScaleS(0) çözüm temizleyerek hazırlayın.<ol>
<li>Belirli oranda ayıraçlar ekleyerek çözüm10 takas ScaleS(0) hazırlamak: % 40 D-(-) sorbitol (w/v), % 10 gliserol, 4,3 M üre ve % 20 Dimetil sülfoksit (DMSO), pH 8.1 (örneğin bir 50 mL konik tüp 2.5 mL gliserol sorbitol 10 g ekleyin , DMSO 5 mL ve 9 M üre için 25 mL toplam hacmi 12 mL. İnversiyon için 30 dk 50 ° C'de tarafından çözüm mix ve kullanımdan önce degas.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çamaşır çözümü kaldırmak ve çözüm Temizleme örnekleri daldırın. Daha iyi sonuçlar için orbital Çalkalayıcı örnekleri korumak.</li>
	<li>Takas çözüm 2 yerine doku şeffaf (yaklaşık 2 gün) hale gelinceye kadar her gün x.</li>
	<li>Doku temizlenir sonra örnek bir para cezası ile kültürlü yumurtalık içeren INSERT membran dikkatlice kaldırarak görüntüleme için hazırlamak ipucu neşter ve örnek bir cam slayt üzerinde yerleştirerek.</li>
	<li>Mikroskop optik kesit yetenekli üzerinde örnekleri Imaging'e devam edin.</li>
</ol>6. oosit miktar
Not: Hücreleri ölçmek mümkün birçok farklı bilgisayar programları vardır. Aşağıda açıklanan kullanarak ticari olmayan görüntü işleme paketi, FIJI-ImageJ14yumurta miktar için bir protokoldür.
<ol><li>Z -yığın görüntü serisi bir düzleştirilmiş maksimum yoğunluk projeksiyon (olmadan DAPI kanal) ilgi belirli hücresel işaretleri kullanarak, görüntüyü bir siyah beyaz görüntü açılan 8-bit görüntü türü ' nün altında dönüştürün. menü.</li>
	<li>Görüntü damla-aşağı yemek listesi altında ayarla sekmesini vurgulamak ve Eşikseçin.</li>
	<li>El ile tek tek her yumurta en iyi tanımlayan bir düzeye eşik ayarlayın. Düzeyi belirlendikten sonra siyah ve beyaz bir görüntü oluşturmak için Uygula ' yı tıklatın. Bir kez tam, örnek belirlenmesinde Oval veya Freehand simgesini kullanarak ölçmek. Not: FIJI-ImageJ ince ayar parçacık miktar için kullanılacak görüntü için farklı seçenekler vardır. Örneğin, süreci içinde | İkili sekmesinde, ne sayılır algılama geliştirmek için kullanılabilecek farklı seçenekler vardır. Şekil 4' te, daha iyi köklerinin kişiselleştirmek için kullanılan seçenekleri Erode boşluğu doldurman gerekve dönüm noktasıson olarak takip, yapıldı.</li>
	<li>Analiz açılır menüsünün altında analizseçen. Parametrelere göre istenen çözünürlüğü ayarla.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture.">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li><li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis.">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+sampling+on+the+reproducibility+of+ovarian+follicle+counts+in+mouse+toxicity+studies.">Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies.</a> Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).</li><li>Skodras, A., Marcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-Generated+Ovaries+to+Assist+Follicle+Counting+Experiments.">Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).</li><li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Whole-Mount+Approach+for+Accurate+Quantitative+and+Spatial+Assessment+of+Fetal+Oocyte+Dynamics+in+Mice.">A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death.">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Maturation+of+mouse+fetal+germ+cells+in+vitro.">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497 (2002).</li><li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary.">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li><li>Byrne, C., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Assays+for+Gene+Induction+and+Barrier+Formation+in+the+Developing+Epidermis.">Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis.</a> Epidermal Cells. , 127-136 (2005).</li><li>Lauter, G., S&#246;ll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Development. 6, 10 (2011).</li><li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice.">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Memeli üreme çalışma kullanarak ve hücre kültürü için rutin olarak mükellef olmayan özel hücreler miktarının gerektirir. Ancak, ex vivo kültür sistemleri yumurtalık ve folikül canlılık1,15Bakımı etkilidir. Yumurtalık kültür sırasında doku Difüzyon yoluyla besin alışverişini için geniş bir yüzey alanı gerektirir. Bu nedenle, yumurtalık boyutunda idealdir ve şekil organ kültür için 5 - gün eski fare. Bu iletişim ku...

Hücresel kompozisyon ve memeli yumurtalık morfolojik özelliklerinin çalışması için bilim adamları çoğunlukla parafin gömülü yumurtalık immunohistological boyama tarafından takip vivo deneyler kullanır. Son zamanlarda tüm yumurtalık organı kültür tekniği daha iyi görselleştirme ile birleştiğinde olabilir çünkü yumurtalık işlev1,2,3,4 çalışma için etkili bir alternatif olduğu ispatlanmıştır rağmen daha fazla ve miktar araçları. Geleneksel olarak, yeniden inşa üç boyutlu yumurtalık mimari gömülü parafin seri bölümlerden ama zahmetli ve zaman tüketmek, seri olarak gömülü parafin doku kesit olmanın yanı sıra yumurtalık Morfoloji analizi bağlıdır değil garanti uygun yeniden yapılanma organ yapar ve bölümler kez kaybolan veya süreç içinde yanlış emretti.
Teknik sorunlar seri kesit ile ilişkili ek olarak, ayrıca düzenli olarak yumurtalık5,6başına folikül numara ölçmek için kullanılan yöntemleri değişimler vardır. Şu anda kullanılan metodolojik değişkenlik meta-analiz yumurtalık rezervinin çalışmaları5,7bozar. Örneğin, farklı araştırma makaleleri folikül numaralardan 10 kat veya daha fazla belirli zorlanma6içinde benzer gelişimsel yaş arası değişebilir. Bu büyük farklılıklar bildirilen folikül miktar karışıklığa yol açabilecek ve çapraz-çalışma karşılaştırmalar engel. Deneysel, folikül miktar geleneksel yaklaşımlar seri bölümlerden bölümleri önceden tanımlanmış bir dizi köklerinin sayarak gerçekleştirilir (Örneğin, her beşinci, onuncu, veya diğer bölüm). Bu yaklaşımı kullanarak folikül sayıları değişkenlik değil sadece hangi bölümlerin sayılır içinde periyodik olarak aynı zamanda varyasyonlarından bölüm kalınlığı ve seri bölümler5,6üreten teknik deneyim ortaya çıkar. Onun değişkenliği ek olarak, geleneksel doku kesit başka bir dezavantaj genç hayvanlardan küçük yumurtalıkların kesit özellikle zorlu ve doku yönlendirme8son derece bağımlı olmasıdır.
İletişim kuralı aşağıdaki rutin olarak kullanılan yumurtalık kültür tekniği1 açıklanır ama fiziksel takas doku ile kesit ve optik confocal mikroskopi8 kullanarak kesit yerine kullanarak geleneksel folikül miktar geliştirir ,9. Bir üre ve sorbitol-tabanlı içinde doku daldırma (ezelî belgili tanımlık lüzum için Transkraniyal perfüzyon veya Elektroforez) kullanarak Temizleme (Örneğin, ScaleS(0)10) çözüm immunostaining ile uyumlu olduğunu kanıtladı ve azaltılması için izin zaman görüntüleme derinliğini ödün vermeden temizlemek. Diğer bildirilen yolu (örneğin, ScaleA28,10, SeeDB11, berrak12ve ClearT212) ya daha fazla zaman alıcı veya derinlemesine optik çözünürlük örnek izin vermez. O daha az emek yoğun olması ve organ'ın üç boyutlu mimari7,8tutar optik kesit avantajlıdır. Örnekleri hazırlanması doku temizlemek için pahalı reaktifler gerektirmez ve göreli kolaylıkla yapılabilir Bu yaklaşımın başka bir şeydir.
Özellikle, açıklanan protokol kültürlü fare yumurtalık için doğum sonrası gün beş optimize edilmiş ama doğum sonrası gün 0 - 10 arasında değişen yumurtalıklarda gerçekleştirilmiştir. Yöntem doku doğal olarak membran üzerinde bu kültürlü, organ işleme ve işleme kolaylaştırmak için verdiği bir yumurtalık kültür sistemi kullanır. Açıklanan kültür sistemi 10 güne kadar ve ne kadar farklı deneysel koşullar değerlendirmek için explanted yumurtalıkların yumurta hayatta kalma13ile girişime neden olabilir korumak için kullanılabilir. Açıklanan miktar yordam ticari olmayan görüntü işleme paket FIJI-ImageJ14 kullanılarak gerçekleştirilir ve çoğu kişisel bilgisayarda yapılabilir. Ayrıca, miktar için kullanılan görüntüleri böylece gelecek meta-analiz için izin bilimsel topluluk için yaygın olarak kullanılabilir duruma getirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Micro dissecting scissor 4.5&quot;, straight, sharp points</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Micro dissecting scissor</td></tr><tr><td>Jewelers style forceps 4-3/8&quot;, style 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Fine tip forceps</td></tr><tr><td>Micro Iris Scissors 4&quot;, straight, sharp points</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Media (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Used in Step 1.3.1</td></tr><tr><td>35mm Tissue Culture Treated Dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Pore size: 8&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>16% solution</td></tr><tr><td>1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator mixer GyroTwister&amp;trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>three dimensional shaker</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumen (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride solution (NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyvinyl Alcohol (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Cold water soluble</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL Syringes</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-MVH antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Dilution 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-mouse 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-rabbit 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Disposable plastic transfer pipettes</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

Memeli üreme biyolojisi alanında araştırma sık sık yumurtalıklar ve testis genel sağlık değerlendirme içerir. Özellikle, kadın, yumurtalık fitness kez görselleştirme ve köklerinin ve yumurta miktarının değerlendirilir. Çünkü yumurtalık opak bir üç boyutlu dokusu, geleneksel yaklaşımlar zahmetle doku hücreleri tüm organ boyunca görselleştirmek için çok sayıda seri bölümlere Dilimleme gerektirir. Ayrıca, miktar tarafından bu yöntem genellikle yalnızca bir alt kümesini bir oosit yaklaşık çapı tarafından ayrılan bölümler puanlama gerektirir çünkü yanlışlık için eğilimli olduğunu. Burada, bir iletişim kuralı yerine tüm organ doku takas ve köklerinin ve yumurta görselleştirmek için fare yumurtalık ayirt boyama kullanan açıklanmıştır. Daha geleneksel yaklaşımlar, bu iletişim kuralını yumurtalık hücrelerde çok sayıda nedenlerle görselleştirme için avantajlı karşılaştırılır: 1) yumurtalık numune hazırlama ve işleme; bozulmadan kalır 2) bölüm için zor olan küçük yumurtalıkların, kolaylıkla incelenebilir; 3) hücresel miktar daha kolay ve doğru bir şekilde elde edilir; ve 4) yansıma tüm organ.

Bu iletişim kuralı 6 önemli adımları içerir diseksiyon yumurtalıklar, şekil 1' de özetlenen takip. Resim 2 , Şekil 3 , Şekil 4 optimizasyonu yumurtalıklar ve FIJI-ImageJ kullanarak tüm doku oosit miktar için Temizleme doku dahil en yeni şekil-in bu protokolü. Şekil 2A (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries at JoVE.com

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Burada, köklerinin genç farelerin kültürlü yumurtalık içinde seri kesit olmadan ölçmek için bir protokol mevcut. Ayirt bütün organ ve doku takas kullanarak, fiziksel kesit optik kesit ile değiştirilir. Bu yöntem örnek hazırlama ve görselleştirme organ bütünlüğü korur ve belirli hücre otomatik miktar kolaylaştırır.

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Görüntüleme.  Cornell University. Burada, köklerinin genç farelerin kültürlü yumurtalık içinde seri kesit olmadan ölçmek için bir protokol mevcut. Ayirt bütün organ ve doku takas kullanarak, fiziksel kesit optik kesit ile değiştirilir. Bu yöntem örnek hazırlama ve görselleştirme organ bütünlüğü korur ve belirli hücre otomatik miktar kolaylaştırır.

Video: Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Gelişim Biyolojisi

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Genetik

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

Vitro Simüle mikrogravite altında fare Preantral follikül gelişimi

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...