Wir danken Rebecca Williams und Johanna Dela Cruz von der Cornell-BRC-Imaging und Andrew Recknagel für Anregungen und technische Hilfe. Diese Arbeit wurde auf der National Institutes of Health Zuschuss unterstützt S10-OD018516 (an Cornells Imaging Facility), T32HD057854, J.C.B und R01-GM45415, J.C.S.

Cornell University institutionelle Animal Care and Verwendung Committee (IACUC) hat alle Methoden, die hier beschrieben wird, in 2004-0038-Protokoll zu JCS zugelassen.
1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien
<ol><li>Wischen Sie der Arbeitsbereich mit 10 % Bleichmittel reinigen und lassen Sie das Bleichmittel auf die Arbeitsfläche Bereich mindestens 5 min lang zu bleiben. Entfernen Sie nach 5 min das überschüssige Bleichmittel mit sauberen Papiertüchern und 70 % Ethanol (EtOH). Reinigen der sezierenden Mikroskop gründlich mit 70 % EtOH. Hinweis: Es ist wichtig, dass der Arbeitsbereich mindestens Semi-zur Vermeidung von Kontaminationen der Orgel Kulturen steril sein.</li>
	<li>Wickeln Sie sauber Pinzetten und Scheren mit einem Papiertuch gedämpft mit 70 % EtOH bis zum Zeitpunkt der Nutzung. Hinweis: Die ideale Dissektion Werkzeuge variieren je nach Alter/Größe des Eierstocks. Beste Ergebnisse werden erzielt, mit einem scharfen Mikro sezierenden Schere, zwei feine Spitze Pinzetten (entweder Nummer 5 oder 55) und einem Mikro sezieren Iris-Schere.</li>
	<li>Machen Sie in einem konischen Rohr 50 mL der Eierstock Kultur, Medien und im Wasserbad 37 ° C Warm.<ol>
<li>Eierstock Kulturmedium4machen, Ergänzung 1 x Minimal Essential Media (MEM) mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), 25 mM (4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 0,25 µg/mL Amphotericin B (z. B. 45 mL MEM, 5 mL Hitze inaktiviert FBS, HEPES 1,25 mL und 0,5 mL 100 X Lager von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platten und Einsätze vor der Eierstock Kultur vorbereiten.<ol>
<li>Fügen Sie in einer Gewebekultur-Haube 1 mL Kulturmedium Eierstock an einer 35 mm-Gewebekultur-Platte.</li>
		<li>Pre-Einweichen einfügen Membran mit dem Kulturmedium. Fügen Sie genügende Medien, in der Regel ca. 0,55 mL pro darüber hinaus bis zur 24-Well-Zellkultur Trägerplatte und Ort einer Zellkultur einfügen in den Brunnen. Sicherstellen Sie, dass die Einlage Membran Medien berührt.</li>
		<li>Die Zahl der 35-mm-Platten und Brunnen mit Zelle Kultur Einsätze entsprechend der erwarteten Anzahl der Eierstöcke im Experiment vorbereiten. Legen Sie die 35 mm-Platten mit 1 mL der Kultur, Medien und die 24-Well-Trägerplatte mit Kultur, Medien und Einsätze in einem 37 ° C, 5 % CO2und atmosphärischen O2 Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordnen Sie eine heiße Platte neben der Dissektion Umfang und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Halten Sie eine 37 ° C, 5 % CO2 und der atmosphärische O2 Inkubator ist in der Nähe der Dissektion Zimmer.</li>
</ol>(2) Eierstock Dissektion und Orgel-Kultur
Hinweis: Eierstöcke können bei Raumtemperatur seziert werden, solange die Belastung durch die nicht-ideale Temperatur minimal ist.
<ol><li>Die weiblichen Mäusen auf postnatale 5.Tag, durch Enthauptung, einzeln nacheinander einschläfern. Hinweis: Sterbehilfe muss nach IACUC-Richtlinien, die in der Einrichtung durchgeführt werden, wo die Forschung durchgeführt wird.</li>
	<li>Sprühen Sie das Tier mit 70 % EtOH. Legen Sie das Tier auf der Oberseite der trockenen Papiertuch unter dem Mikroskop Dissektion. Legen Sie eine 35 mm-Gewebekultur-Schale mit Eierstock Nährmedien in der Nähe der Dissektion Mikroskop.</li>
	<li>Machen Sie mit Zange oder einer Schere Mikro Dissektion Iris einen Schnitt durch die Haut des Tieres und in die Bauchhöhle mit Vorsicht, nicht in den Darm geschnitten. Schieben Sie den Darm aus der Bauchhöhle und suchen Sie die Eierstöcke. Extrahieren Sie die Eierstöcke und legen Sie sie in der Gewebekultur 35-mm-Schale mit Nährmedien.</li>
	<li>Sobald die Eierstöcke vom Tier seziert wurden, erhöhen Sie die Vergrößerung des Mikroskops Dissektion um Eierstöcke und alle angehängten Gewebe sichtbar zu machen. Mit reinigen Sie feiner Spitze Zange, entfernen Sie alle nicht-eierstockgewebe, wie Bursa und Fettgewebe. Achten Sie darauf, um die Eierstöcke intakt zu halten, wenn die beigefügte nicht ovariellen Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Sobald die Eierstöcke isoliert sind, legen Sie das Paar in die eingeweichter Zelle Kultur Einsätze der Träger 24-Well-Platte (siehe Schritte 1.4.2 und 1.4.3) und stellen Sie die Lautstärke des Mediums zu gewährleisten, dass es ausreicht, um die Orgel feucht zu halten (ohne komplett Eintauchen). Achtung: Darauf achten, kein Loch in der Membran der Zelle Kultur einfügen stecken, wenn die Eierstöcke zu übertragen.</li>
	<li>Ort explantiert Organe in einem 37 ° C, 5 % CO2und atmosphärischen O2 Inkubator.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6 bis die Eierstöcke der einzelnen Tiere seziert und auf die Zellkultur platziert von der 24-Well-Platte mit dem Eierstock Kulturmedium einfügen.</li>
	<li>Änderung der Eierstock Kulturmedium alle 2 Tage mit Eierstock Medien Aliquote von 37 ° C Wasserbad erwärmt und fahren Sie mit Teil 3 des Protokolls zum gewünschten experimentelle Zeitpunkt.</li>
</ol>(3) Gewebe Fixierung
<ol><li>In einem 15 mL konische Rohr 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten (z. B. hinzufügen 2 mL 16 % PFA Elektronenmikroskopie Grade 6 mL 1 X PBS). Achtung: PFA ist ein Gefahrstoff und unter einer chemischen Haube bearbeitet werden sollen.</li>
	<li>Die kultivierten Eierstöcke zu beheben, ohne Entfernung des Gewebes aus dem Kultur einfügen, indem Sie das Gewebe mit den frisch zubereiteten 4 % PFA-Lösung abdecken. Seal die Ränder der Platte mit Kunststoff Kleber (um Verdunstung zu vermeiden) und legen Sie die Proben bei 4 ° C über Nacht. Hinweis: Zur Vereinfachung der Handhabung und Gewebe Integrität vermeiden Sie verdrängen Eierstöcke aus der Zelle-Kultur-Einsatz während des gesamten Verfahrens. Kultivierte Eierstöcke an der Oberfläche des Einsatzes befestigt sind vorteilhaft für die Handhabung ohne Beschädigung oder Verlust der Orgel.</li>
	<li>Spülen Sie das Gewebe 3 X mit 70 % EtOH und entweder fahren Sie mit Schritt 4.1 oder laden es in Funkeln Fläschchen gefüllt mit 70 % EtOH bei 4 ° C bis zu Weiterverarbeitung. Hinweis: Wenn Sie Gewebe endogen verwenden kann mit dem Ausdruck fluoreszierende Proteine, Lagerung der Proben mit 70 % EtOH stark das Signal verringern. Alternativ kann Gewebe gespült und in die PBS mit 0,2 % Natriumazid (NaN3) gespeichert werden. NaN3 ist jedoch hochgiftig und stellt eine ernsthafte Inhalation Gefahr. Vorratslösung in der Dunstabzugshaube und Griff tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung wie ein Labor Mantel und Nitril-Handschuhe.</li>
</ol>4. ganze Mount Immunfluoreszenz
<ol><li>Legen Sie das fixierte Gewebe in 1 X PBS bei RT für ein Minimum von 4 h vor dem Permeabilisierung Schritt 4.3.</li>
	<li>Permeabilisierung Lösung und blockierende Lösung vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung, wie beschrieben. 1 X PBS fügen Sie hinzu, 0,2 % Polyvinylalkohol (PVA), 0,1 % Natrium Natriumborhydrid (NaBH4) Lösung (von 12 wt.% in 14 M Natronlauge (NaOH) Lösung) und 1,5 % Polyethylenglykol Tert -Octylphenyl Äther (nicht-ionische Tenside Reinigungsmittel). In einem 50 mL konische Rohr, fügen 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 50 µL NaBH4und 750 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel, dann ultrapure Wasser bis zu 50 mL und bei Zimmertemperatur rühren, bis die Mischung vollständig in Lösung.</li>
		<li>Bereiten Sie blockierende Lösung, wie beschrieben. 1 X PBS hinzufügen 0,1 % nicht-ionische Tenside Reinigungsmittel, 0,15 % von 2,5 M Glycin pH 7.4, 10 % normalem ziegenserum, 3 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,2 % NaN3, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL Amphotericin B. bereiten eine Stammlösung der 2,5 M Glycin durch Auflösen von 93,8 g Glycin Reinstwasser zu einem Endvolumen 500 mL (pH 7,4) und eine Stammlösung 10 % NaN3 durch 5 g in 50 mL hochreines Wasser auflösen; dann, in einem 50 mL konische Röhrchen bereiten Sie die blockierende Lösung durch Zugabe von 5 mL 10 X PBS, 50 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel, 750 µL der Stammlösung Glycin, 5 mL ziegenserum, 1,5 g BSA, 1 mL der Stammlösung NaN3 , und 0,5 mL 100 X Lager von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. Fügen Sie Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 mL und Spritze Filter die endgültige Lösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie und verwerfen Sie 1 X PBS aus der Durchstechflasche zu, und fügen Sie genug Permeabilisierung Lösung um die Eierstöcke vollständig untertauchen. Legen Sie die Probe in Permeabilisierung Lösung auf einem Orbitalschüttler (z. B. Nutator) für 4 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Inkubationszeit variieren abhängig von der Dicke der Orgel.</li>
	<li>Ersetzt die Permeabilisierung Lösung mit genügend blockierende Lösung um die Eierstöcke komplett zu versenken. Versiegeln Sie das Fläschchen mit dem Kunststoff Kleber und lassen Sie das Gewebe für ein Minimum von 12 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubieren.</li>
	<li>Bereiten Sie Primärantikörper Verdünnung in blockierende Lösung gemäß Datenblatt des Herstellers. Hinweis: Beachten Sie, dass nicht alle Antikörper mit dem Clearing Agent kompatibel sind. Das durchschnittliche Volumen pro Probe erforderlich ist etwa 750 µL.<ol>
<li>Für die Quantifizierung der Eizelle, verwenden TAp63 (nukleare Eizelle Marker) und MVH (zytoplasmatischen Keimzelle Marker). Hinweis: Die Antikörper in die Immunfluoreszenz-Bilder verwendet werden Maus Anti-p63 und Kaninchen Anti-MVH). Die primären Antikörper-Lösung kann wiederverwendet werden 2 X oder mehr, wenn bei 4 ° C zwischen Färbung Protokolle gespeichert und korrekt behandelt, um bakterielles Wachstum zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie den Einsatz, die das Gewebe in einer 24-Well-Platte enthält, und fügen Sie ca. 750 µL Primärantikörper Lösung. Sicherstellen Sie, dass die Eierstöcke vollständig eingetaucht sind. Dichtplatte mit Kunststoff Kleber Verdunstung minimieren und lassen das Gewebe für 4 Tage bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler inkubieren.</li>
	<li>Waschlösung vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie Waschlösung wie beschrieben vor. Fügen Sie 1 X PBS zu machen 0,2 % PVA und 0,15 % nichtionische Tenside Reinigungsmittel. Fügen Sie in einem 50 mL konische Röhrchen 5 mL 10 x PBS, 0,1 g PVA, 75 µL der nichtionischen Tenside Reinigungsmittel und Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie Primärantikörper Verdünnung zu, und fügen Sie eine großzügige Menge der Waschlösung. Immer darauf achten Sie, um die Eierstöcke zu versenken. Lassen Sie die Eierstöcke in die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur auf die Orbitalschüttler einweichen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Waschlösung und inkubieren Sie auf Orbitalschüttler für 2 h oder mehr.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Schritt 4,9 eine zusätzliche Zeit.</li>
	<li>Vorbereiten der Sekundärantikörper Verdünnung in blocking-Lösung. Hinweis: Die sekundäre Antikörper verwendet, sind Anti-Maus 488 Fluoreszenzfarbstoff aufgewachsen in Ziege und Anti-Kaninchen 594 Fluoreszenzfarbstoff wuchs in Ziege. Siehe Punkt 4.5. für das durchschnittliche Volumen pro Probe benötigt.</li>
	<li>Entfernen Sie Waschlösung aus den Eierstöcken zu und fügen Sie sekundäre Antikörper-Lösung. Die Proben vor Licht (Wrap-Platte mit Alu-Folie) zu schützen und die Dichtplatte mit Kunststoff Kleber um Verdunstung zu minimieren. 2 Tage inkubieren Sie Proben auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur. Hinweis: Auch die Proben vor Licht mit Aluminiumfolie bei allen anschließenden Inkubation Arbeitsschritten zu schützen.</li>
	<li>Entfernen Sie Sekundärantikörper Lösung aus den Proben zu, und fügen Sie Waschlösung. Auf einem Orbitalschüttler für 8 h inkubieren. Hinweis: Nach Wunsch 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung fügen Sie 50 ng/mL des DAPI der ersten Waschschritt (~ 8 h Inkubation hinzu).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Waschlösung für eine Übernachtung zu waschen.</li>
	<li>Während der Vorbereitung der Clearing-Lösung (siehe Abschnitt 5), ersetzen Sie die Waschlösung mit frischer Lösung über Nacht und die Proben auf die Orbitalschüttler bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
</ol>(5) Eierstock Clearing und Imaging
<ol><li>Bereiten Sie ScaleS(0) clearing-Lösung.<ol>
<li>Bereiten Sie ScaleS(0) clearing-Lösung10 durch Zugabe von Reagenzien in einem bestimmten Verhältnis: 40 % D-(-) Sorbit (w/V), 10 % Glycerin, 4,3 M Harnstoff und 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), pH 8.1 (z. B. in einem 50 mL konische Rohr, Hinzufügen von 2,5 mL Glycerin, 10 g Sorbit , 5 mL DMSO und 12 mL von 9 M Harnstoff für ein Gesamtvolumen von 25 mL. Mischen Sie Lösung durch Inversion bei 50 ° C für 30 min und degas vor Gebrauch.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Waschlösung und Tauchen Sie die Proben im clearing-Lösung. Erhalten Sie für bessere Ergebnisse Proben auf die Orbitalschüttler.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Clearing-Lösung 2 x täglich, bis das Gewebe wird transparent (ca. 2 Tage).</li>
	<li>Sobald das Gewebe deaktiviert ist, bereiten die Probe für die Bildgebung durch sorgfältig entfernen die einfügen-Membran mit kultivierten Eierstöcke mit einer Geldstrafe Tipp Skalpell und platzieren die Probe auf einem Objektträger.</li>
	<li>Fahren Sie mit imaging die Proben am Mikroskop in der Lage, optische schneiden.</li>
</ol>(6) Eizelle Quantifizierung
Hinweis: Es gibt viele verschiedene Computerprogramme, die in der Lage, Zellen zu quantifizieren sind. Nachfolgend beschriebenen ist ein Protokoll für die Quantifizierung der Eizelle mit dem nichtkommerziellen Bild-Verarbeitung-Paket, Fidschi-ImageJ14.
<ol><li>Mit einer abgeflachten Beihilfehöchstintensität Projektion der Z -Stapel-Bild-Serie für die spezifischen zellulären Marker (ohne DAPI-Kanal), konvertieren Sie das Bild in ein schwarz / weiß 8-Bit-Bild unter Typ in der Bild -Dropdown-Liste Menü.</li>
	<li>Markieren Sie unter dem Bild Dropdown-Menü die Registerkarte " Anpassen " und wählen Sie dann die Schwelle.</li>
	<li>Manuell passen Sie an, die Schwelle zu einem Niveau, das am besten jedes einzelne Eizelle identifiziert. Sobald die Ebene festgelegt ist, klicken Sie auf anwenden , um ein schwarz-weiß Bild zu erzeugen. Abschluss, quantifizieren Sie die Probe mithilfe von trennenden Oval oder Freehand -Symbol. Hinweis: Fidschi-ImageJ verfügt über verschiedene Optionen zur Feinabstimmung des Bildes, die für die Quantifizierung der Partikel verwendet werden. Zum Beispiel in Prozess | Binäre tab, gibt es verschiedene Optionen, die zur Verbesserung der Erkennung von was gezählt wird. In Abbildung 4die Optionen zum Follikel besser individualisieren war Erodieren, gefolgt von Löcher füllenund schließlich Wasserscheide.</li>
	<li>Wählen Sie unter Analyze -Drop-Down-Menü Analyze Partikel. Legen Sie die Parameter entsprechend der gewünschten Auflösung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture.">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li><li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis.">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Studium der Säugetier-Wiedergabe erfordert verwenden und Quantifizierung von spezialisierten Zellen, die nicht routinemäßig Zellkultur zugänglich sind. Ex-Vivo -Kultur-Systeme sind jedoch wirksam am Eierstock und Follikel Lebensfähigkeit1,15beibehalten. Während der Eierstock Kultur erfordert das Gewebe eine größere Fläche für den Austausch von Nährstoffen durch Diffusion. Also, 5 - Tage alten Maus Eierstöcke eignen sich in Größe und For...

Um die zelluläre Zusammensetzung und morphologischen Merkmale von Säugetieren Eierstöcke zu studieren, setzen Wissenschaftler oft auf in Vivo Experimente gefolgt von immunohistologische Anfärbung der Eierstöcke Paraffin eingebettet. Vor kurzem, obwohl ganze Eierstock Orgel Kultur erwiesen hat eine effektive Alternative zu eierstockfunktion1,2,3,4 zu studieren, weil die Technik mit besseren Visualisierung gekoppelt werden kann und Quantifizierung Werkzeuge. Traditionell, hängt Analyse der Eierstöcke Morphologie von Rekonstruktion dreidimensionaler Eierstock Architektur von Schnittserien Paraffin eingebettet, aber abgesehen davon, dass mühsam und zeitaufwendig, seriell Paraffin eingebettete Gewebe schneiden tut nicht garantiert korrekte Rekonstruktion der Orgel, und Abschnitte oft verloren gehen oder falsch bestellte in den Prozess.
Neben den technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit seriellen Schnitt gibt es auch Unterschiede in den Methoden routinemäßig verwendet, um Follikel Nummern pro Eierstock5,6zu quantifizieren. Die methodische Variabilität derzeit verwendet beeinträchtigt Meta-Analyse der ovariellen Reserve über Studien5,7. Zum Beispiel können Follikel Zahlen aus verschiedenen wissenschaftlichen Artikeln von 10-divisibel oder mehr zwischen ähnlichen Entwicklungsstörungen Alters innerhalb einer bestimmten Belastung6variieren. Diese großen Unterschiede in den gemeldeten Follikel Quantifizierung können zu Verwirrung führen und Kreuz-Studie Vergleiche behindert haben. Experimentell, traditionelle Ansätze zur Quantifizierung der Follikel von Schnittserien von zählen Follikel eine vordefinierte Anzahl von Abschnitten ausgeführt werden (z. B. jeden fünften, zehnten, oder anderen Abschnitt). Variabilität im Follikel zählt mit diesem Ansatz entsteht nicht nur aus der Periodizität in welche Abschnitte gezählt werden, sondern auch von Variationen in Schnittdicke und technische Erfahrung in der Erzeugung von Schnittserien5,6. Zusätzlich zu ihrer Variabilität ist ein weiterer Nachteil der traditionellen Gewebe zu schneiden, dass die schneiden kleine Eierstöcke von jungen Tieren besonders anspruchsvoll und stark abhängig von Gewebe Orientierung8.
Das Protokoll unten beschreibt eine routinemäßig verwendeten Eierstock Kultur Technik1 aber stark verbessert traditionelle Follikel Quantifizierung durch Substitution von physischen Schneiden mit Gewebe clearing und optischer Schnitt mit der konfokalen Mikroskopie8 ,9. Clearing mit Gewebe Eintauchen (ohne die Notwendigkeit für Transkranielle Perfusion oder Elektrophorese) in eine Harnstoff - und Sorbit-basierte Lösung (z. B. ScaleS(0)10) erwies sich mit der Immunostaining kompatibel und erlaubt für die Reduzierung der Clearing-Zeit ohne Tiefe der Bildgebung. Andere berichteten Methoden (z.B., ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12und ClearT212) sind entweder mehr Zeit verbrauchen oder erlauben keine gründliche optischen Auflösung der Probe. Optischer Schnitt ist vorteilhaft, weil es weniger arbeitsintensiv und die Orgel dreidimensionale Architektur7,8 unterhält. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Vorbereitung der Proben erfordert keine teure Reagenzien um das Gewebe zu löschen und kann mit relativer Mühelosigkeit durchgeführt werden.
Insbesondere das Protokoll beschrieben wurde optimiert für kultivierten Maus Eierstöcke bei postnatalen Tag fünf aber am Eierstock von postnatale Tag 0 - 10 durchgeführt wurde. Die Methode nutzt ein Eierstock Kultursystem, in dem das Gewebe natürlich auf die Membran auf dem kultiviert legt, Orgel Bearbeitung und Manipulation zu erleichtern. Das beschriebene Kultursystem kann verwendet werden, zu pflegen, dass Eizelle überleben13explantierten Eierstöcke für bis zu 10 Tage und zu beurteilen, wie die verschiedenen experimentelle Bedingungen stören können. Die Quantifizierung beschrieben erfolgt mit Hilfe der nichtkommerziellen Bildverarbeitungs-Paket Fidschi-ImageJ14 und kann auf den meisten PCs durchgeführt werden. Darüber hinaus können Bilder zur Quantifizierung weithin verfügbar für die wissenschaftliche Gemeinschaft, damit zukünftige Meta-Analyse erfolgen.

<table><tbody><tr><td>Micro dissecting scissor 4.5&quot;, straight, sharp points</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Micro dissecting scissor</td></tr><tr><td>Jewelers style forceps 4-3/8&quot;, style 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Fine tip forceps</td></tr><tr><td>Micro Iris Scissors 4&quot;, straight, sharp points</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Media (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Used in Step 1.3.1</td></tr><tr><td>35mm Tissue Culture Treated Dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Pore size: 8&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>16% solution</td></tr><tr><td>1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator mixer GyroTwister&amp;trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>three dimensional shaker</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumen (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride solution (NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyvinyl Alcohol (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Cold water soluble</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL Syringes</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-MVH antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Dilution 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-mouse 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-rabbit 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Disposable plastic transfer pipettes</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

Forschung auf dem Gebiet der Säugetier-Reproduktionsbiologie umfasst oft die Auswertung des Gesamtzustand der Eierstöcke und Hoden. Insbesondere bei Frauen, Eierstöcke Fitness oft bemisst sich durch Visualisierung und Quantifizierung der Follikel und Eizellen. Da der Eierstock eine undurchsichtige dreidimensionale Gewebe ist, erfordern traditionelle Ansätze mühsam Schneiden des Gewebes in zahlreichen Schnittserien um Zellen im ganzen das ganze Organ sichtbar zu machen. Darüber hinaus da Quantifizierung von dieser Methode in der Regel nur eine Teilmenge der in den Abschnitten, die getrennt von der ungefähre Durchmesser eine Eizelle erzielte umfasst, ist es anfällig für Ungenauigkeit. Hier wird ein Protokoll beschrieben, die stattdessen nutzt ganze Organ Gewebe Clearing und Immunfluoreszenz-Färbung der Maus Eierstöcke Follikel und Eizellen zu visualisieren. Im Vergleich zu traditionellen Ansätzen, dieses Protokoll ist vorteilhaft für die Visualisierung von Zellen innerhalb des Eierstocks aus vielerlei Gründen: 1) der Eierstock bleibt im gesamten Probenvorbereitung und Verarbeitung; (2) kleine Eierstöcke, die schwer zu Abschnitt sind, können mit Leichtigkeit untersucht werden; (3) zellulären Quantifizierung wird leichter und genauer erreicht; und 4) das gesamte Organ abgebildet.

Dieses Protokoll enthält 6 große Schritte folgen Dissektion der Eierstöcke, wie in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 , Abbildung 3 , Abbildung 4 markieren Sie die neuen Features dieses Protokolls, die Optimierung des Gewebes clearing für Eierstöcke und ganze Gewebe Eizelle Quantifizierung mit Fidschi-ImageJ ent...

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Aufrufe.  Cornell University. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Serie: Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Genetik

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...