有用な提案や技術支援、レベッカ ・ ウィリアムズとコーネル BRC イメージングからヨハンナ Dela クルスとアンドリュー Recknagel に感謝します。この作品は国立衛生研究所健康補助金に支えられた (コーネル大学のイメージング施設) に S10 OD018516、J.C.B. に T32HD057854、J.C.S. に R01 GM45415

コーネル大学の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、議定書 2004-0038 JCS にここでは、記載されているすべてのメソッドを承認しました。
1. 楽器及び培地の調製
<ol><li>ワイプ作業領域 10% の漂白剤できれいにでき、漂白剤を少なくとも 5 分作業エリア表面上に残ります。5 分後に、きれいなペーパー タオルと 70% のエタノール (エタノール) 余分な漂白剤を削除します。きれいに徹底的に 70% で解剖顕微鏡江藤。 注: 作業領域が少なくとも半器官培養の汚染を避けるため無菌であることが重要です。</li>
	<li>70% で湿らせた紙タオルできれいな鉗子、はさみをラップ使用時までエタノール。 注: 理想的な解剖ツールは卵巣の年齢やサイズによって異なります。1 つ鋭いマイクロ解離シザー、2 つファインチップ鉗子 (いずれか 5 または 55 号) を使用して最高の結果が得られますと 1 つマイクロ アイリス シザーを解剖します。</li>
	<li>コニカル チューブ 50 mL 卵巣文化メディアと 37 ° C の水浴の暖かいを確認します。<ol>
<li>子房培養培地4をするためには、補足 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、25 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL 最小重要な媒体 (MEM) x 1アムホテリシン B (FBS、HEPES、1.25 mL とペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 mL と例えばMEM、45 mL、5 mL の熱不活化)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートと子房培養前挿入を準備します。<ol>
<li>ティッシュ文化フードの 35 mm の組織培養プレートに卵巣培養液 1 mL を追加します。</li>
		<li>事前ソークは、培養液で膜を挿入します。よく 24 ウェル キャリア組織培養プレートと場所細胞培養に挿入さて、あたり約 0.55 mL、通常十分なメディアを追加します。挿入の膜に触れるメディアであることを確認します。</li>
		<li>35 mm プレートと実験で卵巣の数に従ってセル文化を挿入して井戸の数を準備します。文化メディアと文化メディアと 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの挿入を含む 24 ウェル キャリア プレートの 1 つの mL を含む 35 mm プレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>郭清範囲の隣のホット プレートを配置し、37 ° C に温度を設定37 ° C、5% CO2を保つため、大気中の O2インキュベーター解剖室に近い。</li>
</ol>2. 卵巣郭清及び器官培養
注: 卵巣は、非理想的な温度への露出が最低限ある限り、室温で切り裂かれます。
<ol><li>1 つずつ斬首で産後 5 日目で雌マウスを安楽死させます。 注: 安楽死は IACUC ガイドライン研究が実行されている施設の存在により実施する必要があります。</li>
	<li>スプレー動物 70 %etoh。解剖顕微鏡の下で乾燥したペーパー タオルの上に動物を配置します。解剖顕微鏡に近い卵巣文化メディアを含む 35 mm の組織培養ディッシュを配置します。</li>
	<li>鉗子や顕微解剖アイリス シザー、腸に切らないように注意を使用して動物の腹腔内に皮膚を切開を行います。腹腔内から腸をプッシュし、卵巣を探します。卵巣を抽出し、培地を含む 35 mm の組織培養皿にそれらを置きます。</li>
	<li>卵巣は、動物から解剖されている、一度卵巣と付属の任意の組織を見やすくために解剖顕微鏡の倍率を増やします。ファインチップ鉗子をきれい、滑液包、脂肪組織など、すべての非卵巣組織を削除します。添付の非卵巣組織を除去するとき、卵巣を壊さないように注意します。</li>
	<li>卵巣が分離されたら、キャリア 24 ウェル プレートの漬け細胞文化挿入ペアを配置 (1.4.2 と 1.4.3 の手順を参照してください) と器官の潤いを保つのに十分であることを確認する媒体のボリュームを調整 (なし完全に水没して)。 注意: は、卵巣を転送するときに細胞培養インサートの膜に穴を突くように注意してください。</li>
	<li>場所は仔 37 ° C、5% CO2の大気中の O2インキュベーターの臓器です。</li>
	<li>2.1 2.6 各動物の卵巣を切除し、細胞培養に配置するまで卵巣培養培地を含む 24 ウェル プレートの挿入手順を繰り返します。</li>
	<li>変更を使用して卵巣培養培地 2 日おきは 37 ° C の水浴から卵巣メディア因数を加温し、目的実験時点でプロトコルのパート 3 に進みます。</li>
</ol>3. ティッシュの固定
<ol><li>15 mL の円錐管にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備 (6 mL の 1x PBS に 16 %pfa 電子顕微鏡グレードの 2 mL の追加など)。 注意: PFA は有害物質で、化学のフードの下で処理する必要があります。</li>
	<li>作りたての 4 %pfa ソリューションと組織を覆うことによって文化の挿入から組織を削除せず培養卵巣を修正します。(蒸発を避けるため) にプラ用接着剤で板の端を密封、4 ° C でサンプルを一晩します。 注: 組織性処理を促進するためにプロシージャ全体でセル文化挿入から卵巣を変位を避けます。チップの表面に付着した培養卵巣処理に有利な損傷臓器を失うことがなく。</li>
	<li>リンス組織 3 x 70 %etoh, いずれかが 4.1 または満ちているシンチレーション バイアルでストアをステップへ進みます 70 %etoh まで 4 ° c をさらに処理します。 注: 内生的組織を用いた場合 70% サンプルを保存の蛍光蛋白質を表現するエタノールを大幅に減らします信号。また、組織を洗浄して、0.2% アジ化ナトリウム (NaN3) と PBS に格納できます。ナン3は、しかし、非常に有毒な深刻な吸入の危険性を提起します。ヒューム フードの原液を行い処理研究室コートとニトリル手袋など適切な保護具を着用します。</li>
</ol>4. 全体のマウント蛍光
<ol><li>4.3 透過ステップ前に 4 h 以上の RT で 1 × PBS で固定ティッシュを置きます。</li>
	<li>透過溶液及びブロッキング溶液を準備します。<ol>
<li>透過ソリューションを準備しています。1 × PBS に 0.2% ポリビニル アルコール (PVA)、0.1% ナトリウム水素化ホウ素 (NaBH4) (から 12 wt.% 14 M 水酸化ナトリウム (NaOH) ソリューションで、ソリューションと 1.5% ポリエチレング リコール-tert-ブチルオクチルフェニル エーテル (非イオン性界面活性剤の洗剤) を追加します。50 mL の円錐管に PBS x 10 の 5 mL、0.1 グラム、PVA、NaBH4の 50 μ L、非イオン性界面活性剤の洗剤の 750 μ L を追加し、超純水を追加 50 mL を水し、混合物がソリューションに完全なるまで室温でよく攪拌します。</li>
		<li>ブロッキング液を準備しています。1 × PBS に 2.5 M グリシン pH 7.4 の洗剤、0.15% 0.1% 非イオン性界面活性剤を追加、10% ヤギ血清、3% ウシ血清アルブミン (BSA)、0.2% ナン3、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL アムホテリシン b. のストック溶液を調製2.5 超純水水 50 mL に 5 g を溶解して純水 500 mL 最終巻 (pH 7.4) にグリシンの 93.8 g と 10% ナン3の原液を溶解することにより M グリシン50 mL の円錐管に 5 mL の 10 x PBS、非イオン性界面活性剤の洗剤、グリシン原液、ヤギ血清、BSA の 1.5 g、ナン3ストック溶液 1 mL の 5 mL の 750 μ L の 50 μ L を追加することによってブロックのソリューションを準備して、、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシン B の 100 x の在庫の 0.5 ml。超純水水 50 mL とシリンジ フィルターの最終巻までに最終的なソリューションを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>削除しバイアルから 1 × PBS を破棄し、卵巣が完全に水没する十分な透過ソリューションを追加します。室温で 4 h 用のシェーカー (例えばnutator) を軌道上で透過ソリューションにサンプルを配置します。 注: インキュベーション時間は、臓器の厚さに応じて異なる場合があります。</li>
	<li>卵巣が完全に水没する十分なブロッキング液で透過ソリューションを置き換えます。プラスチック接着剤でバイアルを密封し、軌道のシェーカーで室温で 12 時間以上培養組織を残します。</li>
	<li>メーカーのデータシートに従ってブロッキング液で一次抗体希釈を準備します。 注意: すべての抗体が決済エージェントと互換性があります。サンプルごとに必要な平均ボリュームは、約 750 μ L です。<ol>
<li>卵母細胞定量用 TAp63 (核卵母細胞マーカー)、mvh 遺伝子 (細胞の生殖細胞マーカー)。 注: 蛍光画像で使用される抗体は、マウス抗 p63 とウサギ抗-mvh 遺伝子)。第一抗体溶解液は再利用 2 をすることができます x 以上の汚損のプロトコル間の 4 ° C で保存および細菌の成長を避けるために正しく処理される場合。</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 ウェル プレートで組織を含む挿入を置き、一次抗体溶液の約 750 μ L を追加します。卵巣が完全に水中に沈むことを確認します。蒸発を最小限に抑え、軌道シェーカーで室温で 4 日間の培養組織を残すプラスチック接着剤で板をシールします。</li>
	<li>洗浄液を準備します。<ol>
<li>洗濯ソリューションを準備しています。1 x PBS を作る 0.2 %pva と 0.15% 非イオン界面活性剤の洗剤を追加します。50 mL の円錐管に 5 mL の PBS x 10、PVA の 0.1 g、非イオン性界面活性剤の洗剤と純水 50 mL の最終巻までの 75 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一次抗体の希釈を削除し、洗浄液の寛大な量を追加します。常に卵巣が水没することを確認します。軌道のシェーカーで室温で一晩溶液中浸漬する卵巣を許可します。</li>
	<li>洗浄液を交換し、2 h 以上の軌道のシェーカーで孵化させなさい。</li>
	<li>4.9 の手順を繰り返して 1 つの追加の時間。</li>
	<li>ソリューションをブロックで二次抗体希釈を準備します。 注: 使用される二次抗体、抗マウス 488 の蛍光色素は、ヤギとヤギで発生した反ウサギ 594 蛍光染料で発生します。4.5 の手順を参照してください。平均ボリュームのサンプルごとに必要です。</li>
	<li>洗濯ソリューションを卵巣から削除し、二次抗体溶液を追加します。光 (アルミ箔ラップ プレート) からサンプルを保護し、蒸発を最小限に抑えるためのプラスチック接着剤で板をシールします。2 日間室温で軌道シェーカーでサンプルをインキュベートします。 注: その後インキュベーションのすべての手順の中にアルミ箔を使用して光からサンプルを保護を続行します。</li>
	<li>サンプルから二次抗体溶液を削除し、洗浄液を追加します。8 h の軌道シェーカーで孵化させなさい。 注: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色が必要な場合は、最初の洗浄のステップ (~ 8 時間培養) に DAPI の 50 ng/mL を追加します。</li>
	<li>一晩洗浄の洗浄ソリューションを取り付けます。</li>
	<li>準備中にクリア ソリューション (セクション 5 を参照) で、洗浄液の新鮮な一晩を置き換えるし、軌道のシェーカーでサンプルを室温で維持します。</li>
</ol>5. 卵巣クリアとイメージング
<ol><li>クリア ソリューション ScaleS(0) を準備します。<ol>
<li>ScaleS(0) 指定された割合で試薬を追加することによってソリューションの10をクリアの準備: 40 %d-(-) ソルビトール (w/v)、20% ジメチルスルホキシド (DMSO)、4.3 M 尿素 10% グリセリン pH 8.1 (例えば50 mL の円錐管にグリセリン、ソルビトールの 10 g の 2.5 mL を追加、DMSO、5 mL と 25 mL の容量のための 9 M の尿素の 12 mL。30 分間 50 ° c のインバージョンによるソリューションをミックスし、使用前にガス抜き)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗濯ソリューションを削除し、ソリューションをクリアするにサンプルが水没します。良い結果を得るのため、軌道シェーカーでサンプルを維持します。</li>
	<li>クリア ソリューション 2 を置き換える × 毎日ティッシュになる透明な (約 2 日) まで。</li>
	<li>組織がクリアされると、罰金と培養の卵巣を含む挿入膜を慎重に外してイメージングのためのサンプルを準備チップ メスとスライド ガラスのサンプルを載せています。</li>
	<li>イメージングの光学断面のできる顕微鏡のサンプルに進みます。</li>
</ol>6. 卵の定量化
注: セルを定量化することができる多くの異なった計算機プログラムがあります。下記は、フィジー ImageJ14非商用画像処理パッケージを使用して卵の定量化のためのプロトコルです。
<ol><li>イメージのドロップダウン リストに [種類]黒と白 8 ビット イメージにイメージを変換 (DAPI チャネル) なし興味の特定の細胞マーカーのz-スタック画像シリーズのフラットな最大強度投影を使用して、メニュー。</li>
	<li>画像のドロップ ダウン メニューの下で調整タブをハイライト表示し、しきい値を選択します。</li>
	<li>それぞれの個々 の卵母細胞を識別するレベルにしきい値を手動で調整するには。一度レベルを決定すると、黒と白のイメージを生成する適用をクリックします。完了すると、視線は楕円形またはフリーハンドのアイコンを使用してサンプルを定量化します。 注: フィジー ImageJ 粒子定量化に使用されるイメージを微調整する別のオプションがあります。例えば、プロセスの |バイナリ] タブで、どのようなカウントされますの検出を改善するために使用できるさまざまなオプションがあります。図 4、良い卵胞を個別に使用するオプションは、浸食、続いて穴を埋めると最後に流域だった。</li>
	<li>分析のドロップ ダウン メニューで、[分析粒子を選択します。目的の解像度によるとパラメーターを設定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li><li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture.">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li><li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis.">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. 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T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death.">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis:+Maturation+of+mouse+fetal+germ+cells+in+vitro.">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497 (2002).</li><li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary.">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li><li>Byrne, C., Hardman, M. 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哺乳類の生殖に関する研究では、細胞培養に日常的に従順ではない特殊な細胞を定量化して、必要があります。ただし、体外培養システムは、卵巣と卵胞の生存率1,15を維持に効果的です。子房培養中に組織拡散を介して栄養素の交換のため表面積が必要です。したがって、5 日間の古いマウス卵巣のサイズが理想的との器官培養形状します?...

細胞構成と哺乳類の卵巣の形態学的特徴を研究するために科学者はしばしば免疫組織学的染色パラフィン埋め込まれた卵巣の続く生体内で実験に依存します。もっと最近しかし、完全な卵巣器官培養が技術することができますより良い可視化と結合するために卵巣機能1,2,3、4を勉強する効果的な代替であると証明し、数量化ツールです。伝統的に、卵巣の形態解析パラフィン埋め込まれた連続切片から、骨の折れる、時間がかかり、連続パラフィン埋め込まれたティッシュの区分であることに加えて再構築の三次元の卵巣アーキテクチャによって異なりますオルガンのない保証の適切な再建をしないとセクションがしばしば紛失またはプロセスで注文ミス。
シリアルセクショニングに関連する技術的な課題に加えて、日常的に卵巣5,6あたりの卵胞数を定量化するために使用方法の変化もあります。現在使用されている方法論的変動研究5,7を越え卵巣予備のメタ分析を損ないます。たとえば、異なる研究論文から卵胞数 10 倍以上特定のひずみ6内と同様の発達年齢間によって異なります。報告された卵胞定量化にこれらの大きな違いは混乱を招く可能性し、クロス研究比較を妨げています。セクションのあらかじめ定義された数の卵胞をカウントすることによって連続切片から卵胞定量化への従来のアプローチを実行する実験的に (例えば、すべての 5 番目、10 番目、または他のセクション)。このアプローチを使用して卵胞数の変動は、切片厚で連続切片5,6を生成する際に技術的な経験だけでなく、セクションはカウント、周期性変化からもを発生します。その変動に加え伝統的なティッシュの別の欠点は、若い動物から小さな卵巣の断面が特に挑戦的な組織向き8に大きく依存することです。
以下のプロトコルは日常的に使用される卵巣文化技術1を記述しますが、クリア組織の物理的な区分および共焦点顕微鏡8 を用いた光学セクショニングを置き換えることによって伝統的な卵胞の定量化に大幅に向上 ,9。クリアで、尿素およびソルビトール ベース組織浸漬 (経頭蓋灌流または電気泳動なし) を使用してソリューションを (例えば、 ScaleS(0)10)、免疫染色と互換性があることを証明し、の減少のため許可イメージングの深さを損なうことがなく時間をクリアします。その他の報告の方法 (例えばScaleA28,10、SeeDB11、ClearT12、および ClearT212) より多くの時間がかかるまたはサンプルの詳細な光学解像度を許可しません。光の断面は、以下の労働集約型であり臓器の三次元アーキテクチャ7、8を保持ため便利です。このアプローチの別の利点は、サンプルの準備組織をクリアする高価な試薬を必要としない比較的容易に行うことができます。
具体的には、説明されたプロトコルは生後 5 日目の培養マウス卵巣に最適化されていますが、生後 0 - 10 から卵巣を実施しました。メソッドでは、組織が自然にそれが培養、臓器処理や操作を促進する膜につく卵巣培養系。説明文化システムは、explanted 卵巣 10 日間までとどのように異なる実験条件を評価するためには、卵母細胞生存13を妨げる可能性を維持するために使用できます。定量化手順処理パッケージ フィジー ImageJ14非商用画像を使用してされるので、ほとんどのパーソナル コンピューターで行うことができます。さらに、将来のメタ分析することができます、科学的なコミュニティのため、定量化に使用するイメージを広く利用可能にすることができます。

<table><tbody><tr><td>Micro dissecting scissor 4.5&quot;, straight, sharp points</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Micro dissecting scissor</td></tr><tr><td>Jewelers style forceps 4-3/8&quot;, style 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Fine tip forceps</td></tr><tr><td>Micro Iris Scissors 4&quot;, straight, sharp points</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Media (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Used in Step 1.3.1</td></tr><tr><td>35mm Tissue Culture Treated Dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Pore size: 8&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>16% solution</td></tr><tr><td>1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator mixer GyroTwister&amp;trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>three dimensional shaker</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumen (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride solution (NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyvinyl Alcohol (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Cold water soluble</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL Syringes</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-MVH antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Dilution 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-mouse 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-rabbit 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Disposable plastic transfer pipettes</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

哺乳類の生殖生物学の分野の研究は、卵巣と精巣の全体的なヘルスを評価をしばしば伴います。具体的には、女性の卵巣のフィットネス頻繁の可視化と定量化卵胞と卵子によって評価されます。卵巣は、不透明な三次元組織は、従来のアプローチは苦心して全体の臓器中の細胞を可視化するために数多くのシリアル セクションにティッシュをスライスを必要です。さらに、このメソッドによって定量化は通常卵のおおよその直径で区切られたセクションのサブセットのみを得点を伴う、ので、不正確になりやすいです。ここでは、プロトコルは、全臓器組織の清算とマウス卵巣卵胞と卵子を視覚化するための免疫蛍光染色を代わりに利用した、説明します。伝統的なアプローチと比較して、このプロトコルは多くの理由で卵巣内の細胞を可視化するため有利である: 1) 卵巣試料調製及び処理全体はそのままセクションすることは困難である 2) 小さな卵巣は容易に調べることができます。3) 携帯電話の数量化をより容易にかつ正確に達成します。・ 4) イメージ全体の器官。

このプロトコルには、六つの主要なステップが含まれている次の卵巣の解剖図 1で説明したよう。図 2, 図 3, 図 4卵巣及びフィジー ImageJ を用いた全ティッシュ卵定量化のクリア組織の最適化を含むこのプロトコルの最も斬新な機能を強調表?...

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K ビュー.  Cornell University. シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

発生生物学

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

遺伝学

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

体外模擬微小重力下でのマウス前胞状卵胞の成長

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

要約

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文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

体外模擬微小重力下でのマウス前胞状卵胞の成長

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

受動的な明快さクリアマウス卵巣の血管の 3次元再構築

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

要約

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文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

体外模擬微小重力下でのマウス前胞状卵胞の成長

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

「マウス卵巣における現象を可視化する卵巣の組織培養

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築

受動的な明快さクリアマウス卵巣の血管の 3次元再構築