우리 유용한 제안 및 기술 지원에 대 한 레 베 카 윌리엄스와 코넬 BRC 이미징에서 요한 나 델라 크루스와 앤드류 Recknagel 감사합니다. 이 작품 건강 그랜트의 국가 학회에 지원 되었다 S10-OD018516 (코넬의 이미징 시설)에, J.C.B.에 T32HD057854와 J.C.S. R01-GM45415

코넬 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 여기, JCS 2004-0038 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법을 승인 했습니다.
1입니다. 악기와 문화 미디어 준비
<ol><li>지우기 작업 영역 10% 표 백제와 깨끗 하 고 적어도 5 분 동안 작업 영역 표면에 표 백제를 허용. 5 분 후 깨끗 한 종이 타 올, 70% 에탄올 (EtOH) 초과 표 백제를 제거 합니다. 70%와 철저 하 게 해 현미경 청소 EtOH. 참고: 작업 영역 적어도 반 기관 문화의 오염을 피하기 위하여 메 마른 것이 중요 하다.</li>
	<li>70%를 적신 종이 타월로 깨끗 한 집게와가 위를 랩 EtOH 사용의 시간까지. 참고: 이상적인 해 부 도구 난소의 나 이/크기에 따라 달라질 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 한 날카로운 마이크로 해 시저, 두 좋은 팁 집게 (중 번호 5 또는 55)를 사용 하 여 얻을 수 있습니다와 아이리스가 위를 해 부 한 마이크로.</li>
	<li>원뿔 튜브에 50 mL의 난소 문화 미디어와 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 확인 합니다.<ol>
<li>난소 배양4을 하려면 최소한의 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 25 m m (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 0.25 µ g/mL x 1을 보충 암포 B (예를 들어, 열 5 mL의 MEM, 45 mL FBS, HEPES, 1.25 mL 및 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 mL 비활성화).</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시와 난소 문화 전에 삽입을 준비 합니다.<ol>
<li>조직 문화 후드에서 35 m m 조직 문화 접시에 난소 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>전 담가 문화 매체와 막을 삽입 합니다. 당 약 0.55 mL, 24-잘 캐리어 조직 배양 플레이트, 그리고 장소는 세포 배양에에서 삽입 잘 일반적으로 충분 한 미디어를 추가 합니다. 삽입의 막 접촉 매체 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>35mm 판과 실험에 난소의 예상된 번호에 따라 셀 문화 삽입과 우물의 수를 준비 합니다. 문화 미디어와 문화 미디어와 37 ° C, 5% CO2, 그리고 대기 O2 인큐베이터에 삽입을 포함 하는 24-잘 캐리어 격판덮개의 1 mL를 포함 하는 35 m m 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>옆 절 개 범위 뜨거운 접시를 준비 하 고 37 ° c 온도 설정 37 ° C, 5% CO2 를 유지 하 고 해 부 룸은 대기 O2 인큐베이터.</li>
</ol>2. 난소 절 개 및 기관 문화
참고: 난소 수 수 해 부 상 온에서 비 이상적 온도에 노출은 최소한으로.
<ol><li>잘린, 한 번에 한 하 여 5, 출생 일에 여성 쥐를 안락사. 참고: 안락사 IACUC 지침 연구 수행 되 고 있는 시설에 따라 실시 해야 합니다.</li>
	<li>동물 스프레이 70 %EtOH. 동물 해 부 현미경 아래 건조 종이 타월 위에 놓습니다. 해 부 현미경 가까운 난소 문화 미디어 포함 35 m m 조직 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>집게 또는 마이크로 해 부 아이리스 시저, 절 개는 피부를 통해 동물의 그리고 복 부 구멍으로 잘라 내장을 안 주의 사용 하 여 확인 합니다. 복 부 구멍에 밀어 내장 하 고 난소를 찾습니다. 난소를 추출 하 고 문화 미디어를 포함 하는 35 m m 조직 문화 접시에 그들을 배치.</li>
	<li>일단 난소에서 동물 해 부 되어 있다, 난소 및 모든 연결 된 조직 증가 하기 위해서는 더 나은 해 부 현미경의 배율 시각화. 좋은 팁 집게 청소, 부르사, 지방 조직 등 모든 비-난소 조직을 제거. 연결 된 비 난소 조직을 제거 하는 경우 난소를 그대로 유지 하는 주의 해야 합니다.</li>
	<li>난소는 격리, 일단 캐리어 24-잘 접시의 미리 젖된 세포 문화 삽입으로 쌍을 배치 (1.4.2와 1.4.3 단계 참조) 오르간을 축축한 유지 하기에 충분을 매체의 볼륨을 조정 하 고 (하지 않고 완전히 물속에 넣는 그것). 주의: 수 난소를 전송할 때 셀 문화 삽입의 막에 있는 구멍을 찌 르 지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>장소 explanted 37 ° C, 5% CO2, 그리고 대기 O2 인큐베이터에서 장기.</li>
	<li>2.1 2.6 각 동물의 난소는 해 부 및 세포 배양에 배치 될 때까지 난소 문화 매체를 포함 하는 24-잘 접시의 삽입 하는 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>변경 사용 하 여 난소 문화 매체 2 일 마다 난소 미디어 aliquots 37 ° C 물 탕에서 따뜻하게 하 고 원하는 실험 시간 지점에서 프로토콜의 3 부로 진행.</li>
</ol>3. 조직 고정
<ol><li>15 mL 원뿔 튜브에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에 4 %paraformaldehyde (PFA) 준비 (예를 들어, 추가 16 %PFA 전자 현미경 학년의 2 mL 1 x PBS의 6 mL). 주의: PFA 유해 물질 이며 화학 후드 처리 해야 합니다.</li>
	<li>취재 갓된 4 %PFA 솔루션으로 조직 하 여 조직 문화 삽입에서 제거 하지 않고 교양된 난소를 수정. 플라스틱 접착제 ()을 피하기 위해 증발 접시의 가장자리를 밀봉 및 샘플 4 ° C에서 밤새 껏 두기 위하여. 참고: 처리 및 조직의 무결성을 촉진 하기 위하여 하지 마십시오 전체 절차를 통해 셀 문화 삽입에서 난소 생기 죠. 삽입의 표면에 부착 된 교양된 난소는 처리에 대 한 유리 손상 또는 기관 잃고 없이.</li>
	<li>3 조직 린스 x 70 %EtOH 고 4.1 또는 섬광 튜브에 가득한 게 단계로 진행 70 %EtOH 4 ° C에서 추가 처리. 참고: 조직 endogenously 사용 하는 경우 70% 샘플을 저장 하는 형광 단백질을 표현 EtOH 크게 줄일 수 신호. 또는 조직 씻어 서 하 고 0.2% 나트륨 아 지 드 (NaN3)와 함께 PBS에 저장 될 수 있습니다. 그러나 NaN3 는,, 매우 독성과 심각한 흡입 위험이. 증기 두건에서 재고 솔루션을 만들고 처리 실험실 코트와 니트 릴 장갑 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용.</li>
</ol>4. 전체 산 면역 형광
<ol><li>Permeabilization 단계 4.3 이전 4 h의 최소 고정된 조직 RT에 1 x PBS에 놓습니다.</li>
	<li>Permeabilization 솔루션 및 차단 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>설명 된 대로 permeabilization 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS를 0.2% 폴 리 비닐 알코올 (PVA), 0.1% 나트륨 borohydride (NaBH4) 솔루션 (12 wt.% 14 M 수산화 나트륨 (NaOH) 해결책에서), 및 1.5% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르 (비 이온 계면 활성 제 세제)를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA, NaBH4, 50 µ L 및 비 이온 계면 활성 제 세제 750 µ L의 0.1 g 추가 다음 초순 추가 최대 50 mL를 물과 혼합 솔루션에서 완전히 될 때까지 실 온에서 잘 선동.</li>
		<li>설명한 대로 차단 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 2.5 M 글리신 pH 7.4의 세제, 0.15% 0.1% 비 이온 계면 활성 제를 추가, 10% 정상 염소 혈 청, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 0.2% 할머니3, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 및 0.25 µ g/mL 암포 B. 준비의 재고 솔루션 2.5 500 mL 마지막 볼륨 (pH 7.4)에 초순에 글리신의 93.8 g와 10% 할머니3 의 재고 솔루션 초순; 50 mL에 5 g을 용 해 하 여 용 해 하 여 M 글리신 그런 다음 50 mL 원뿔 튜브에서 10 x PBS, 비 이온 계면 활성 제 세제, 글리신 재고 솔루션, 염소 혈 청, 1.5 g, BSA의 NaN3 재고 솔루션의 1 mL의 5 mL의 750 µ L의 50 µ L의 5 mL을 추가 하 여 차단 솔루션 준비 100 x 재고 페니실린, 스, 암포 B의 0.5 ml. 50 mL 주사기 필터의 마지막 볼륨까지 초순 최종 솔루션을 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제거 및 유리병에서 1 x PBS를 삭제 하 고 완전히 난소 잠수함 충분 한 permeabilization 솔루션을 추가 합니다. 궤도 셰이 커 (예: nutator) 실 온에서 4 시간에 permeabilization 솔루션에서 샘플을 놓습니다. 참고: 보육 시간 기관 두께 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>Permeabilization 솔루션을 완전히 난소 잠수함 충분 한 차단 솔루션 바꿉니다. 플라스틱 접착제로 유리병을 밀봉 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 12 h의 최소 잠복기를 둡니다.</li>
	<li>제조업체의 데이터 시트에 의하여 차단 솔루션에서 기본 항 체 희석을 준비 합니다. 참고: Note 모든 항 체 개간 에이전트와 호환 됩니다. 샘플 당 필요한 평균 볼륨은 약 750 µ L.<ol>
<li>Oocyte 정량화 사용 TAp63 (핵 oocyte 마커)과 MVH (세포질 세균 셀 표식). 참고: 면역 형광 이미지에 사용 되는 항 체는 마우스 안티-p63, 토끼 안티-MVH). 1 차적인 항 체 솔루션 재사용된 2 수 x 이상의 프로토콜을 얼룩이 지 사이 4 ° C에 저장 하 고 박테리아의 성장을 방지를 제대로 처리 하는 경우.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24-잘 접시에 조직을 포함 하는 삽입 놓고 1 차적인 항 체 솔루션의 약 750 µ L를 추가 합니다. 난소는 완전히 빠져들 확인 합니다. 증발을 최소화 하 고 조직 궤도 셰이 커에 실 온에서 4 일 동안 잠복기를 두고 플라스틱 접착제로 접시를 봉인.</li>
	<li>세척 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>설명 된 대로 세척 솔루션을 준비 합니다. 1 x PBS, 하 게 0.2 %PVA 0.15% 비 이온 계면 활성 제 세제를 추가 합니다. 50 mL 원뿔 튜브에서 PBS x 10의 5 mL, PVA의 0.1 g, 비 이온 계면 활성 제 세제와 50 mL의 최종 볼륨까지 초순 75 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 차적인 항 체 희석 제거 하 고 세척 솔루션의 관대 한 금액을 추가. 항상 잠수함 난소를 확인 하십시오. 궤도 셰이 커에 실 온에 하룻밤 솔루션에 담가 난소를 허용 합니다.</li>
	<li>세척 솔루션을 장착 하 고 2 시간 이상 궤도 셰이 커에 품 어.</li>
	<li>4.9 단계 반복 하 여 하나의 추가 시간.</li>
	<li>솔루션을 차단에 이차 항 체 희석을 준비 합니다. 참고: 사용 하는 2 차 항 체는 반대로 마우스 488 형광 염료 염소와 염소에서 안티 토끼 594 형광 염료에서. 4.5 단계를 참조 하십시오. 평균 볼륨에 대 한 샘플 당 필요합니다.</li>
	<li>난소에서 세척 솔루션을 제거 하 고 이차 항 체 해결책을 추가 하십시오. 빛 (알루미늄 호 일 포장 판)에서 샘플을 보호 하 고 증발을 최소화 하기 위해 플라스틱 접착제로 접시를 봉인. 2 일 동안 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 품 어. 참고: 샘플을 보호 하는 알루미늄 호 일을 사용 하 여 모든 후속 인큐베이션 단계에서 계속 합니다.</li>
	<li>이차 항 체 솔루션 샘플에서 제거 하 고 세척 해결책을 추가 하십시오. 8 h는 궤도 흔드는에 품 어. 참고: 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩은 원하는 경우, 첫 번째 세척 단계 (~ 8 h 외피)에 DAPI의 50 ng/mL를 추가 합니다.</li>
	<li>하룻밤 세척을 위한 세척 솔루션을 교체 합니다.</li>
	<li>준비 하는 동안 개간 솔루션 (섹션 5 참조), 신선한 솔루션으로 솔루션을 세척 하는 하룻밤을 장착 하 고 실 온에서 궤도 셰이 커에 샘플을 계속.</li>
</ol>5입니다. 난소 지우기 및 이미징
<ol><li>ScaleS(0) 솔루션을 청소 준비 합니다.<ol>
<li>ScaleS(0) 주어진된 비율에 시 약을 추가 하 여 솔루션10 삭제 준비: 40 %D-(-) 톨 (w/v), 10% 글리세롤, 4.3 M 요소, 및 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), pH 8.1 (예: 50 mL 원뿔 튜브에 추가 글리세롤, sorbitol의 10 g의 2.5 mL DMSO의 5 mL 및 9 M 우 레 아 25 mL의 총 볼륨의 12 mL. 30 분 동안 50 ° C에서 반전 하 여 솔루션을 믹스와 사용 전에 드.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 솔루션을 제거 하 고 솔루션을 지우기에 샘플 잠수함. 더 나은 결과 위해 궤도 셰이 커에 샘플을 유지 합니다.</li>
	<li>2 청소 솔루션을 대체 조직을 투명 하 게 (약 2 일) 될 때까지 매일 x.</li>
	<li>조직에는 선택이 취소 되어, 일단 준비 샘플 영상에 대 한 신중 하 게 벌금 교양된 난소를 포함 하는 삽입 멤브레인을 제거 하 여 메스 고 유리 슬라이드에 샘플 배치 팁.</li>
	<li>영상 현미경 광학 단면 수에 샘플으로 이동 합니다.</li>
</ol>6. oocyte 정량화
참고: 셀을 정할 수 있는 많은 다른 컴퓨터 프로그램 있습니다. 아래 설명 된 oocyte 정량화 피지 ImageJ14비 상업적 이미지 처리 패키지를 사용 하는 프로토콜이입니다.
<ol><li>이미지 이미지 드롭-다운에서 형식 에서 흑인과 백인 8 비트 이미지로 변환 (DAPI 채널) 없이 관심의 특정 세포 표식에 대 한 Z-스택 이미지 시리즈의 병합된 최대 강도 투영을 사용 하 여, 메뉴입니다.</li>
	<li>이미지 메뉴에서 조정 탭을 강조 표시 하 고 임계값을 선택 합니다.</li>
	<li>수동으로 가장 각 개별 oocyte 식별 수준 임계값을 조정. 수준이 결정 되 면 흑백 이미지를 생성 하려면 적용 을 클릭 합니다. 완료 되 면, 타원형 또는 Freehand 아이콘을 사용 하 여 묘사 하 여 샘플을 계량. 참고: 피지 ImageJ는 미세 입자 정량화에 사용 될 이미지를 조정 하려면 다른 옵션이 있습니다. 예를 들어, 과정에에서 | 바이너리 탭, 계산 될 것입니다 무슨의 탐지를 향상 하는 데 사용할 수 있는 다른 옵션이 있다. 그림 4에서는 더 낭을 개별화 하는 데 사용 하는 옵션 Erode, 구멍 채우기, 및 마지막으로 유역이었다.</li>
	<li>분석 메뉴에서 분석 입자를 선택 합니다. 원하는 해상도 따라 매개 변수를 설정 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence.">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles.">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. 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저자는 공개 없다.

포유류 복제의 연구를 사용 하 여 정기적으로 세포 배양에 의무가 있지 않은 특수 셀을 측정 해야 합니다. 그러나, 문화 시스템 비보 전 난소 및 여 포 생존1,15유지에 효과적입니다. 난소 문화 중 조직 확산을 통해 영양분의 교환에 대 한 더 큰 표면 영역을 필요합니다. 따라서, 5 일 오래 된 마우스 난소 크기에 이상적입니다 및 장기 문화에 대 한 ?...

세포질 구성 및 포유류 난소의 형태학 상 특징을 공부 하기 위하여 과학자 들은 종종 vivo에서 실험 뒤에 immunohistological 포함 된 파라핀 난소의 얼룩에 의존 합니다. 최근에 그러나, 전체 난소 기관 문화 기술은 더 나은 시각화와 결합 될 수 있다 때문에 난소 기능1,2,,34 를 공부 하는 효과적인 대안이 될 수 입증 하고있다 더 많은 고 정량화 도구입니다. 전통적으로, 난소 형태학의 분석 3 차원 재구성 난소 아키텍처 파라핀 임베디드 직렬 섹션에서 하지만 되기 힘들고 시간이 걸리고, 순차적으로 포함 된 파라핀 조직 단면에 따라 달라 집니다. 기관의 적절 한 개조를 보장 하지 않으며 섹션 자주 분실 또는 잘못 주문 과정에서.
직렬 구분과 관련 된 기술 과제, 이외에 정기적으로 여 포 난소5,6당 숫자를 계량 하는 데 사용 하는 방법에 변화가 있습니다. 현재 사용 하는 방법론 변화 연구5,7에 걸쳐 난소의 메타 분석을 손상 한다. 예를 들어 다른 연구 기사에서 여 포 숫자 특정 스트레인6내에서 유사한 발달 세 사이 이상의 사진에 의해 달라질 수 있습니다. 보고 뿌리 부 량에 큰 차이이 혼란으로 이어질 수 있습니다 고 간 연구 비교를 방해. 실험적으로, 직렬 섹션에서 뿌리 정량화 하는 기존의 방법과 섹션의 미리 정의 된 수의 모 낭을 계산 하 여 수행 됩니다 (예를 들어, 모든 다섯 번째, 10 번째, 또는 다른 섹션). 이 방법을 사용 하 여 포 수 있는 가변성 섹션 두께, 경험과 기술 직렬 섹션5,6생성에 섹션 계산에 주기에서 뿐만 아니라 변화에서 발생 합니다. 그것의 다양성 뿐만 아니라 다른 전통적인 조직 단면 단점은 젊은 동물에서 작은 난소의 단면화는 특히 도전적이 고 매우 조직 방향8에 의존.
프로토콜 아래 일상적으로 사용 된 난소 문화 기술1 설명 하지만 전통적인 뿌리 정량화 조직 삭제와 실제 단면 및 광학 단면 confocal 현미경8 사용 하 여 대체 하 여 크게 향상 시켰습니다. ,9. 에 요소 및 솔 비 톨-기반 조직 집중 (하지 않아도 transcranial 관류 또는 전기 이동 법)을 사용 하 여 삭제 솔루션 (예를 들어, ScaleS(0)10)는 immunostaining와 호환 되 고 입증의 감소에 대 한 허용 화상의 깊이 손상 없이 개간 시간. 다른 보고 된 방법 (예, ScaleA28,10, SeeDB11,12, ClearT 및 ClearT212) 하나 더 많은 시간을 소비 또는 샘플의 깊이 있는 광학 해상도 허용 하지 않습니다. 광 단면 적은 노동 집약 이며 오르간의 3 차원 건축7,8을 유지 하기 때문에 유리 하다. 이 방법의 또 다른 이점은 샘플의 준비 조직을 값비싼 시 약을 필요로 하지 않습니다 및 상대적으로 쉽게 수행할 수 있습니다.
특히, 설명 하는 프로토콜은 출생 후 하루 5 교양된 마우스 난소에 대 한 최적화 되었습니다 하지만 출생 후 일 0-10에서에서 배열 하는 난소에 실시 되었습니다. 메서드는 자연스럽 게 조직에 그것은 경작, 기관 처리 및 조작을 용이 하 게 하는 막에 부착 하는 난소 문화 시스템을 사용. 설명 하는 문화 시스템 최대 10 일 동안을 어떻게 다른 실험 조건 평가 explanted 난소 oocyte 생존13방해할 수 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 설명 정량화 절차 처리 패키지 피지 ImageJ14 비 상업적 이미지를 사용 하 여 수행 하 고 대부분 개인용 컴퓨터에서 수행할 수 있습니다. 또한, 정량화에 대 한 사용 되는 이미지 만들 수 있습니다 광범위 하 게 사용할 수 있는 미래의 메타 분석에 대 한 되므로, 사회 과학에 대 한.

<table><tbody><tr><td>Micro dissecting scissor 4.5&quot;, straight, sharp points</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Micro dissecting scissor</td></tr><tr><td>Jewelers style forceps 4-3/8&quot;, style 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Fine tip forceps</td></tr><tr><td>Micro Iris Scissors 4&quot;, straight, sharp points</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Media (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Used in Step 1.3.1</td></tr><tr><td>35mm Tissue Culture Treated Dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Pore size: 8&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>16% solution</td></tr><tr><td>1X Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Nutator mixer GyroTwister&amp;trade;</td><td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td><td>three dimensional shaker</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumen (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride solution (NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Use the solution, rather than the tablet or powder form&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyvinyl Alcohol (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Cold water soluble</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL Syringes</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-p63 antibody (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-MVH antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Dilution 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-mouse 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; goat anti-rabbit 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Disposable plastic transfer pipettes</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

whole mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries

포유류 생식 생물학의 분야에 있는 연구는 종종 난소와 고환의 전반적인 건강을 평가 포함 됩니다. 특히, 여성, 난소 피트 니스는 시각화 및 낭과 oocytes를 측정 하 여 평가 자주. 난소는 불투명 한 3 차원 조직 이기 때문에 전통적인 접근 힘들게 부 러 뜨 리는 조직의 수많은 직렬 섹션으로 전체 기관에 걸쳐 세포를 시각화 하기 위해 필요 합니다. 또한,이 방법으로 정량화는 일반적으로 점수는 oocyte의 대략적인 직경에 의해 구분 된 섹션의 하위 집합만 수반, 때문에 그것은 부정확 하 경향이 있다. 여기, 프로토콜 대신 전체 장기 조직 개간 및 면역 형광 마우스 난소 낭과 oocytes 시각화의 얼룩을 활용 하 여 설명 합니다. 전통적인 방법에 비해,이 프로토콜은 수많은 이유로 난소 내 세포를 시각화에 대 한 유리: 1) 난소 보존할 샘플 준비와 처리; 섹션에 어렵다, 2) 작은 난소; 쉽게 시험 될 수 있다 3) 세포질 부 량은 더 쉽게 그리고 정확 하 게 달성; 그리고 4) 몇 군데 전체 기관.

6 주요 단계를 포함 하는이 프로토콜 난소의 절 개를 그림 1에 설명 된 대로 다음. 그림 2 , 그림 3 , 그림 4 조직 난소와 피지 ImageJ를 사용 하 여 전체 조직 oocyte 정량화에 대 한 삭제의 최적화를 포함 하는이 프로토콜의 가장 새로운 기능을 강조...

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K 조회수.  Cornell University. 여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

연구

발생학

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

유전학

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial follicles, the storage unit of the female germline. They are non-renewable, thus their number at birth and subsequent rate of loss largely dictates the female fertile lifespan. Accurate quantification of primordial follicle numbers in women and animals is essential for determining the impact of medicines and toxicants on the ovarian reserve. It is also necessary for evaluating the need for, and success of, existing and emerging fertility preservation techniques. Currently, no methods exist to accurately measure the number of primordial follicles comprising the ovarian reserve in women. Furthermore, obtaining ovarian tissue from large animals or endangered species for experimentation is often not feasible. Thus, mice have become an essential model for such studies, and the ability to evaluate primordial follicle numbers in whole mouse ovaries is a critical tool. However, reports of absolute follicle numbers in mouse ovaries in the literature are highly variable, making it difficult to compare and/or replicate data. This is due to a number of factors including strain, age, treatment groups, as well as technical differences in the methods of counting employed. In this article, we provide a step-by-step instructional guide for preparing histological sections and counting primordial follicles in mouse ovaries using two different methods: [1] stereology, which relies on the fractionator/optical dissector technique; and [2] the direct count technique. Some of the key advantages and drawbacks of each method will be highlighted so that reproducibility can be improved in the field and to enable researchers to select the most appropriate method for their studies.

Here, we describe, compare, and contrast two different techniques for accurate follicle counting of fixed mouse ovarian tissues.

성인 마우스 난소의 정확한 여포 열거

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...