Jolanta Chmielowiec Protokolü ve el yazması ile ilgili yararlı tartışma için teşekkür ediyoruz. Biz de Benjamin Arenkiel erişim confocal mikroskop için teşekkür ederim. Bu eser NIH (M.B. için P30-DK079638) ve T32HL092332-13 M.A.S ve M.B., McNair tıbbi Vakfı (M.B.) ve confocal özünde BCM fikri ve gelişme bozuklukları Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir (NIH U54 HD083092 Eunice üzerinden Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan gelişimi).

Bu yöntemde açıklanan tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Baylor Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.
1. fare embriyonik gün 10,5 pankreas ataları hazırlanması
Not: diseksiyon .aletleri sterilize ve kullanmadan ile % 70 etanol önce sprey uygunudur ancak bu protokolü kadar adım 2, steril koşullarda izlenecek gerekmez.
<ol><li>Diseksiyon için ayarlamak için bir buz kovası doldurun ve buzun içinde bir kap fosfat tamponlu tuz (PBS) yerleştirin. İki ince uçlu forseps ve diseksiyon makası % 70 etanol ile temizleyin. Yakın olan diseksiyon alanına ayarla, en az üç borosilikat kapiller içeren bir kapsayıcı, bir ağız pipet, bir çakmak, tüpler ve 1000 µL pipet ipuçları filtre.<ol>
<li>En az 1 mL steril su ve buz üzerinde 12 iyi plaka ikinci iyi yerde seyreltilmiş 1.25 mg/mL soğuk dispase hazırlayın. PBS birinci, üçüncü ve dördüncü koymak wells 12 de plaka. Yer 1 mL % 0.05 tripsin 1,5 ml tüp buz üzerinde. 37 oC. titreyen bir kuluçka önceden ısıtmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>E10.5 zaman aşımına uğradı-hamile fareler IACUC kurallar uyarınca ötenazi. Karın bir V şeklinde kesi genital bölge, makas ve forseps kullanarak fare yapmadan önce bölgenin temiz ve diyafram kadar devam etmek için % 70 etanol ile sprey. Not: Bu protokol vajinal bir eklenti görünümü gün 0,5 belirtir. 5 - 6-hafta-yaşlı fareler, kullanma daha--dan 2 g bir kilo alımı başarılı emprenye ikincil bir ölçüsü olarak davranır.<ol>
<li>Dikkatli bir şekilde rahim, rahim, karşı tarafta tekrarlanmadan önce yukarı doğru uzak fare ve bu kesi aşağıdaki organ genital bölge aşağı çekerek en üst lateral bölümlerini bir kesi yaparak tüketim. 10 cm soğuk PBS ile Petri kabına yerleştirin. Not: E10.5 pancreatoids, aksine bu organoids değil henüz karakterize edilmektedir ve bu nedenle tüm üç büyük pankreas soy ayırt etmek için kapasite tutmamayı ancak organoids ayrışmış e11.5 hücrelerinden elde etmek mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir ışık diseksiyon mikroskop altında Petri kabına yerleştirin ve dikkatle her embriyo arasında iki forseps yerleştirip doku sarısı sac uzak soyulması rahim dokusu açın. Sarısı sac forseps ve yeri 10 cm ile taze, Petri kabına yavaşça ile açgözlü tarafından embriyo transfer soğuk PBS. Petri kabına buza koyun. Not: Heedfully embriyo, tercihen güçlü kaldırma doku embriyo sökük ve yapısal bütünlüğü tehlikeye göbek kordonu, indirebiliriz sarısı sac içinde muhafaza kaldırmak önemlidir.</li>
	<li>Birden çok PBS damla bir 10 cm Petri kabına kapağını yerleştirin. Bu damlacıkları extraembryonic dokularının görünürlük sağlamak için kaldırılır gibi embriyo diseksiyon sırasında aktarmak için kullanın. Bir PBS damla için bir embriyo transfer ve kalan embriyolar PBS buz (Şekil 1A) içinde kalırken forseps, kullanarak sarısı sac yavaşça kaldırın. Baş hafifçe, embriyonun doku (Şekil 1B) hasar için kepçe forseps kullanarak yeni bir PBS damla embriyo geçmeden önce kaldırın. Not: Doku daha sık taze PBS damlacıkları için burada, sıvı opaklık bağlı olarak açıklanan aktarılması gerekir.<ol>
<li>Yeni bir PBS düşüş forseps (Şekil 1B) kullanarak forelimb tomurcukları kaldırın. Yer forseps açılış içine nerede kol bud mevcuttu ve yavaşça sadece en dış doku anteriorly gözyaşı (Şekil 1B). Embriyo döndürmek ve hindlimb bud durdurma arka yönde tekrarlayın. Bu noktada, gastrointestinal sistem görünür (Şekil 1B) olmalıdır.</li>
		<li>Gastrointestinal sistem arka bölge (Şekil 1F) hafif bir viraj var. Bu bend arkasında forseps açılış gastrointestinal sistem ve vücut duvar spinal bölge arasında ekleyin. En ön bölge nerede kalp bölge (Şekil 1B-E) bağlanan ulaşılana kadar yavaş yavaş yukarı doğru çalışma gastrointestinal sistem bağlantısını kesin. İsteğe bağlı: ilkel kalp ve karaciğer tomurcukları gastrointestinal sistem sadece sürekli gut tüp bırakarak, ventral bölgelerden kaldırma. Bu iletişim kuralı gerçekleştirilir ilk birkaç kez kalp ve karaciğer morfolojisi, gastrointestinal sistem ve dorsal pankreas tomurcuk kadar ventral yerlerinden daha fazla olduğu gibi bırakmak daha kolay olabilir tanıdık (Şekil 1C ve D ).</li>
		<li>Gastrointestinal sistem taze PBS damlacık aktarın.</li>
		<li>Forseps alıp hafifçe çıkıntılı bud ve bağırsak altında doku çimdik ve biraz (Şekil 1D-F) kapalı dış doku kaldırın. Not: Dorsal pankreas bud mide ve bağırsak (Şekil 1C-G) arasında yer almaktadır. Altında belgili tanımlık pankreas gonca gibi yuvarlak, budaklı yapı (Şekil 1G) bakmak gerekir.</li>
		<li>Forseps nereye belgili tanımlık gonca bağırsak ve yukarı doğru bud (Şekil 1G) gevşetmek için çimdik bağlanır koyun. Bir kez yeni bir PBS balonun içinde belgili tanımlık gonca soğuk PBS 12 iyi plaka ilk kuyunun içine buzda aktarmadan önce yıkayın. Tüm tomurcukları embriyo toplanan ve 12 iyi plaka ilk kuyuda yerleştirilir kadar yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işık diseksiyon mikroskop altında 12 iyi çanak yerleştirin. Pankreas tomurcukları başarıyla sonra split oranını hesaplamak için disseke saymak.<ol>
<li>Yer bir filtre uygulanmış 1.000 µL pipet ucu içine ağzını pipet kılcal tüp ile bağlı. Alev kılcal tüp sterilize ve kullanım kolaylığı için tüp viraj oluşturun. Kılcal temiz PBS (Şekil 1G) ile üçüncü de aktarmadan önce ikinci de içeren soğuk dispase çözüm için 2 dk tomurcukları aktarmak için kullanın. Not: tomurcukları dispase PBS'ye aktarma sırasında doku Kılcal boru ucuna dokunmaktan kaçının. Eğer doku tüpün ucunda takılıyor, yukarı ve aşağı pipet veya gevşetti kadar temiz PBS çözümde sallamayın.</li>
		<li>Tomurcukları yukarı ve aşağı pipet ve temiz PBS ile dördüncü de aktarın. Son olarak, kapiller aygıt aktarması kullanarak tomurcukları 1,5 mL tüp ile % 0.05 tripsin. Önceden ısıtılmış 37 oC shaker tüpü yerleştirin ve 4 dk için 1500 rpm'de sallamak.</li>
		<li>Yaklaşık 10 için girdap s sonra hemen yer tüp bir santrifüj ve spin 200 5 min için g. kaldırmak ama yaklaşık 50 µL çözüm dikkatli centrifuged hücreleri (Şekil 1G) rahatsız değil gibi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. kültür Disosiye ataları Pancreatoids oluşturmak için
Not: Aşağıdaki standart steril prosedürler kullanarak standart doku kültürü Hood, steril bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>Toplanan her bud için 400 µL organogenesis medya16,17 (Tablo 1) centrifuged hücrelere ekleme. Girdap üç kez darbe ve plaka 100 µL düşük ek 96 kuyu başına iyi tomurcukları (Şekil 1G) 1:4 oranında bölme plakası.</li>
	<li>Mikroskop altında ilişkisini görselleştirmek için (resim 1H) serbestçe yüzen hücreleri denetleyin. 37 oC kuluçka %5 CO2 orta hızda bir rocker kültür çanak yerleştirin.</li>
	<li>Her gün pancreatoids ilerlemesini izlemek. 100 µL taze medya her 3 günde hood pancreatoid kuyuda bırakarak kaldırmak için mikroskobik kontrol altında dikkatle pipetting medya ile değiştirin. Alternatif olarak, medya taze 100 µL yeni iyi ve pancreatoid kullanarak transfer ağzını pipet ve 1000 µL bağlı borosilikat kılcal tüp pipet ucu filtre ekleyebilirsiniz.</li>
</ol>3. işlem Pancreatoids immünfloresan görüntüleme için
<ol><li>Pancreatoids immünfloresan görüntüler için işlemek için ilk %4 paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) çözüm hazırlamak. Yer 50 µL % 4'lük PFA 96 Wells de plaka.<ol>
<li>Borosilikat kılcal tüpler ve ağzını pipet 1000 µL süzülmüş pipet ucu ile kullanarak, kültür % 4 ile taze kuyuya mümkün olduğu kadar az medya alarak orta pancreatoids transfer PFA. 15 dakika oda sıcaklığında rocker üzerinde ayarlayın.</li>
		<li>Pancreatoids 4'den % aktarım PFA taze PBS, 100 µL ile bir kuyuya rock, oda sıcaklığında 5-10 dakika tekrar olmak üzere toplam üç taze PBS yıkar, için. Not: Protokol burada, pancreatoids bir hafta kadar PBS 100 µL 4 oC, depolanan ile duraklatılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wholemount görüntüleme için (antikorlar bölümünde 3.3 uygun, alternatif bir yaklaşım olup tavsiye. ve 3.4 mikroskobu.), PBS 1 x PBS % 0,1 Noniyonik deterjan (PBST) ile 50 µL % 5 eşek serum içine engellemek için transfer. Gecede 4 oC rock ya da alternatif olarak, oda sıcaklığında 4 h için.<ol>
<li>Birincil antikorlar % 5 eşek serum 1 50 µL içinde seyreltilmiş içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. En iyi şekilde, rock 4 oC 24 h (en az 12 h ama en fazla 36 saat) için. Not: Malzeme tablo Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) ve Pdx1 karşı antikorlar listelenen (1: 100) uygun wholemount boyama için; diğer antikorlar optimizasyonu gerektirebilir.</li>
		<li>Pancreatoids yıkama ve oda sıcaklığında 30 dakika rock taze PBST 100 µL içeren bir de aktarın. Toplam üç taze PBST yıkama için bu adımı yineleyin.</li>
		<li>İkincil antikorlar % 5 eşek serum 1 50 µL içinde seyreltilmiş içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. Plaka ışıktan korumak ve 4 oC, en iyi şekilde 24 saat (en az 12 h ama en fazla 36 saat) için sallanan yer. Not: Malzeme tablo ve DAPI nükleer counterstain listelenen tüm ikincil antikorlar wholemount boyama için uygundur.</li>
		<li>1 x PBST ve kaya, oda sıcaklığında 1'deki üç yıkar, toplam 30 dk. tekrar 100 µL içeren yeni bir kuyu pancreatoids transfer x PBST. Üçüncü ve son yıkama eklemek 300 nM DAPI.</li>
		<li>Son olarak, temiz PBS ve 4 oC confocal mikroskobu tarafından Imaging önce bir haftaya kadar ışık için en iyi sonuçları görüntüleme hemen sonra boyama geldi rağmen korunuyorsunuz mağazasında 100 µL yerleştirin. Görüntüleme sırasında pancreatoids hareketi engellemek, ancak kurumasını önlemek için her pancreatoid PBS 20 µL damlacık yerleştirin. Pancreatoids hala kalmaz, PBS ses azaltın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Donmuş bölümleri için pancreatoids PBS % 30 sükroz çözüm gecede 4 EyC. içine transfer<ol>
<li>Bir kabarcığın diseksiyon mikroskop altında gömme medya ekleyin. Mikroskobik kontrol altında forseps kullanarak, pancreatoids hafifçe gömme medya yoluyla birkaç kez bir doku blok dondurulmuş gömme medya ile aktarmadan önce kalan sükroz kaldırmak için iterek emmek.</li>
		<li>Kuru kadar donmuş buz blokta doku ve Bölüm 8 µm, cryostat yerleştirin. Not: Bölümler-80 oC veya immunostained hemen depolanabilir.</li>
		<li>Kuru kadar yaklaşık 5 min için oda sıcaklığında erimek için-80 oC bölümleri sağlar. Hidrofobik pap kalemi doku ve % 5 eşek serum 1'seyreltilmiş kullanarak blok etrafında bir hidrofobik bariyer çizmek için oda sıcaklığında 30 dk x PBST.</li>
		<li>Medyayı çıkarın ve birincil antikorlar % 5 eşek serumda PBST gecede 4 EyC. 1 x seyreltilmiş seyreltilmiş hemen yerine</li>
		<li>Birincil çözümü kaldırmak ve yıkama doku üç kez ile 1 x PBST 10 dk için. Bunu 1'seyreltilmiş %5 eşek serumda seyreltilmiş ikincil antikor çözüm ekleyin x PBST oda sıcaklığında 1 h için ve slaytlar ışıktan korumak.</li>
		<li>İkincil çözümü kaldırmak ve yıkama slaytlar üç kez 1 ' x PBST 10 dk için. Son yıkama 300 eklemek nM DAPI.</li>
		<li>Medyayı çıkarın ve montaj medya ve bir coverslip ekleyin. Mağaza 4 oC ışıktan uzak görüntü için hazır kadar slaytlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. transkript analiz için Pancreatoids gelen RNA izolasyon
<ol><li>Borosilikat kılcal bir ağız pipet ile bir filtre uygulanmış 1.000 µL pipet ucu kısırlık ve yer için 500 µL asit guanidinium thiocyanate-fenol-kloroform çözüm bir 1,5 mL tüp içine bağlı kullanarak pancreatoids toplamak. -80 oC depolamak veya hemen RNA izolasyon için ilerlemek.</li>
	<li>RNA izolasyonu için gerekirse örnekleri buz çözme ve kloroform 100 µL ekleyin. Girdap iyi ve yerinde 4 oC 15 dakika süreyle santrifüj 4 oC. önceden serin<ol>
<li>Tüpler santrifüj ve 20 dk 4 oC., 12.000 g de tur içine koyun</li>
		<li>Tüpler katmanları ayrılması değil rahatsız etmek için dikkatli bir şekilde çıkarın. 200 µL pipet kullanarak, açık sulu çözüm toplamak ve küçük bir miktar beyaz protein katman ve pembe DNA katmanı arabelleğe bırakarak yeni bir 1,5 mL tüp içine yerleştirin. Bu süreçte bir şey için pipet ucu dokunma ve 1,5 mL tüp duvarlara dokunma.</li>
		<li>% 100 isopropanol 500 µL sulu katman ve girdap içeren yeni tüp ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dk, buz üzerinde daha uzun veya en fazla yağış oturmak izin bırakın gecede-20 oC.</li>
		<li>RNA cips için 4 oC de 15 dakika 12.000 g, santrifüj kapasitesi. İsopropanol Pelet bozmadan kaldırın. Not: pancreatoids küçük olduğu için bu pelet görünür olmaması olasıdır.</li>
		<li>Soğuk, % 75 etanol ekleyin ve tüp birkaç kez tersine çevirin. Santrifüje yerleştirin ve 9000 x g 10 dk 4 oC. Kaldır az için etanol ve spin 9000 x g de 2 min için spin.</li>
		<li>200 µL pipet Pelet bulunan bölge bağlantı kurmadan tüpte kalan herhangi bir etanol kaldırmak için kullanın. Kap buharlaşma kalıntısı etanol sağlamak için oda sıcaklığında 5-10 dk Tube açık bırakın.</li>
		<li>Pelet içinde temiz, nükleaz ücretsiz su 20 µL vortexing tarafından resuspend. İsteğe bağlı: Isı RNA, 65 oC 3 dk ve hemen buz için dönün. RNA-80 oC depolanan veya hemen ters transkripsiyon ve qPCR için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dawn+of+the+organoid+era:+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development,+disease,+and+regeneration.">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells.">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency.">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).</li><li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pancreatitis.">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+signals,+and+lineages+in+pancreas+development.">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li><li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors.">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells.">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation.">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li><li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1++pancreatic+progenitor+cells.">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool.">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors.">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney.">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li><li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells.">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li><li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromogranins+A+and+B:+the+first+25+years+and+future+perspectives.">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li><li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes.">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).</li><li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes.">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li><li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients:+prevalence,+mechanisms,+and+treatment.">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).</li><li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes.">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).</li><li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin.">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Hücre kültür modelleri ilerlemesini düzgün geliştirme modeli, klinik hücre tipleri, test ilaç etkinliğini veya hastalara bile nakli üretmek için çok önemlidir. Biz hala organogenesis ve Fizyoloji mekanizmaları anlama çok uzak olduğu gibi ancak, yapay bir tabak içinde kalkınma recapitulating meydan okuyor içinde vivo. Böylece vitro hücre verimsiz oluşturulan, tam olarak fonksiyonel değil, uzun bir süre için muhafaza edilmesi veya diğer anormallikler vücuttaki karşılaştırıl...

Normal gelişim ve fizyolojisi mekanizmaları operasyona hastalığı nedenleri anlamak ve sonuçta tedavi yöntemleri yetiştirmek için her şeyden önemlidir. Kültür ve kök hücre ayırt gelişimin hızlı ve yüksek üretilen iş analizi olanak sağlarken, bilgi ile ilgili hücre kader düzenleyen mekanizmalar mevcut vücut ile sınırlıdır ve yapay olarak gelişiminde beyannamedir bir nispeten homojen, iki boyutlu durum1,2. Sadece dışsal etkiler, farklı hücre tipleri niş ve çevre ile etkilenen vivo içinde geliştirme sağlayan parakrin sinyalleri ve örgütsel destek organogenesis rehberlik etmek, ama Ayrıca bu hücrelerin işlevini kullanır onların çevresi için rehberlik3,4,5. Bu dış yardımlar önemi, farklılaşma protokolleri sınırlamalar ve in vivo fare modelleri zahmetli doğası göz önüne alındığında, yeni sistemleri temel gelişimsel süreçleri ve Fizyoloji deneysel olarak araştırmaya ihtiyaç vardır.
Üç boyutlu, karmaşık organoids oluşturmak için iletişim kuralları ortaya çıkması organogenesis, fizyoloji, uyuşturucu etkinlik ve hatta patogenezinde. eğitim için uygun ve uyumlu bir sistem sağlar Mide ve bağırsak6 7 gibi farklı sistemleri organogenesis anlayışımızı genişlettik için fare organoids kurulması, gelişimsel karmaşıklığı vivo içinde daha az kısıtlamalarla çalışma için bir araç sağlayan ve vitro modelleri. Fare organoid bu gelişmeler nedeniyle oluşumu ve insan pluripotent gelişiyle kök hücreleri, insan bağırsak8, Retina9, böbrek10,11ve serebral12 organoids üretilen ve bu repertuar sadece gelişiminin mekanizmaları ile ilgili mevcut bilgi ile sınırlıdır.
Pankreas farklı hücre tipleri, ekzokrin pankreas yetmezliği13, pankreatit14, acinar hücrelerde acinar hücreleri ve kanalları dahil olmak üzere sayısız hastalıklar veba gibi özel ilgi pankreas organoids olduğunu ve Beta hücreleri diyabet15dakika sonra. Bu farklı hücre tipleri geliştirilmesi ile ilgili bilgi kazanıyor onların patoloji anlamada yardımcı olabilir ve ayrıca, kişiselleştirilmiş uyuşturucu tarama veya nakli için bir platform olarak hareket edebilir. Daha önce Greggio ve ark. vivo içinde morfogenez özetlemek ve tüm büyük pankreas epitel hücre oluşur organize, üç boyutlu, karmaşık yapıları geliştirmek fare pankreas organoids oluşturmak için bir yöntem geliştirdi 16,17türleri. Bu pankreas alanında önemli bir adım, özellikle yapım hücreleri vitro beta-hücre gelişimi biyolojik incelenmesi etkinleştirebilirsiniz. Ancak, organoids nerede etkileşim burnu ile Öğretim İpuçları17sağlamak dokusu içine nakledilen sürece bir kıtlık endokrin hücre bu protokol için kurdu. Mezenşim ağır endokrin delaminasyon ve farklılaşma3,4de dahil olmak üzere daha sonraki aşamaları için organogenesis erken aşamalarında gelen epitel gelişmekte olan Zarflama niş, en büyük kısmını teşkil eder, 18. Mezenşim etkileşim gelişmekte olan pankreas henüz dışsal sinyal ve in vivo hücresel karmaşıklık sürdürmenin önemini organogenesis çalışmak için başka bir örnektir.
Burada, pancreatoids, Disosiye e10.5 fare pankreas ataları olarak adlandırdığı üç boyutlu pankreas organoids oluşturmak nasıl açıklar. Bu pancreatoids yerel Mezenşim korumak, serbest dalgalı koşullarda kendini birleştirin ve endokrin beta hücreleri19sağlam bir dizi de dahil olmak üzere tüm büyük pankreas hücre tipleri oluşturmak. Önceki iletişim kuralları sağlam endokrin farklılaşma bulunmadığından bu yaklaşım endokrin geliştirme, analiz için uygundur. Ancak, pankreas organoids için iletişim kuralını kullanarak vd. daha iyi pankreas epitel dallanma ve morfogenez, analiz için uygun Greggio tarafından açıklandığı gibi dallanma olarak daha pancreatoids içinde sınırlıdır.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Nuclease-free water</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillary Tubes</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Repellent 96-Well Microplate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>U-bottom</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Compact, Modular Stereo Microscope M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidine-2&#039;-phenylindole-dihydrochloride)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Powder</td></tr><tr><td>DBA antibody</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Powder</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip</td></tr><tr><td>EGF (Epidermal growth factor)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Antibody</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>Polyclonal Mouse IgG</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Antibody</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Polyclonal Guinea Pig</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Mouse C-Peptide ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Microtome Blades</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 antibody</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Monoclonal Mouse MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5mL Capacity</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-10 Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-Acidic</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human R-Spondin I Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), no Phenol Red</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>For cell counting slides</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Phenol Red</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 24-Well Plate</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Polyclonal Chicken IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochloride</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1254</td><td>Also known as ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of scaffold-free, three-dimensional insulin expressing pancreatoids from mouse pancreatic progenitors in vitro

Pankreas karmaşık bir organ kan glikoz homeostazı ve sindirimi düzenler için birlikte çalışan birçok farklı hücre türleri modülüdür. Bu hücre türleri acinar hücreleri, bir arborized duktal sistem gut ve hormon üreten endokrin hücrelere sorumlu enzimleri ulaşım için enzim salgılayan içerir.
Endokrin beta hücreleri tek hücre tipi vücuttaki insülin kan şekeri düzeylerini düşürmek için üretmek vardır. Diyabet, bir kayıp veya beta hücre fonksiyon bozukluğu ile karakterize bir hastalık salgın boyutlarına ulaşıyor. Böylece, araştırmak amacıyla filtreleme için ilaç ve tedavi hücre tabanlı türetmek için kullanılan beta-hücre gelişimi için iletişim kuralları kurmak için önemlidir. Fare geliştirme deneysel incelenmesi gerekli olmakla birlikte, in vivo çalışmalar zahmetli ve zaman alıcı vardır. Kültürlü hücreleri filtreleme için daha uygun bir platform sağlamak; Ancak, hücresel çeşitlilik, mimari organizasyon ve hücresel etkileşimlerin bulundu korumak edemiyoruz içinde vivo. Böylece, pankreas organogenesis ve Fizyoloji araştırmak için yeni araçlar geliştirmek esastır.
Hücreleri düzenleyebilir ve karmaşık, fizyolojik olarak yetkili yetişkin organ ayırt pankreas epitel hücreleri Mezenşim organogenesis başlangıcından ile yakın ilişki içinde geliştirmek. Pankreas Mezenşim birçoğu de henüz, böylece sırasında vitro kültür özetlemek zor anlaşılır değil önemli sinyalleri endokrin gelişmesi için sağlar. Burada, biz pancreatoids olarak adlandırdığı Mezenşim korumak kültür üç boyutlu, hücresel karmaşık fare organoids için bir iletişim kuralı tanımlamak. E10.5 fare pankreas bud disseke, ayrışmış ve iskele-Alerjik bir ortamda kültürlenir. Bunlar yüzen hücreleri gelişmekte olan pancreatoid ve endokrin beta hücreleri gelişmekte olan acinar ve kanal hücreleri ile birlikte sağlam bir dizi Zarflama Mezenşim ile kendini topla. Bu sistem organogenesis sırasında ya da uyuşturucu, küçük molekül veya genetik tarama için hücre kader tayini, yapısal organizasyonu ve morfogenez, hücre-hücre etkileşimleri eğitim için kullanılabilir.

Fare embriyolar rahim boynuz dan e10.5, dikkatli diseksiyon PBS hasarsız embriyo için daha fazla diseksiyon (Şekil 1A) verim. Gastrointestinal sistem verimli bir şekilde dorsal pankreas bud bağırsak ve mide (Şekil 1C-F), muhakeme izin embriyo (Şekil 1B), kaldırılabilir. E10.5 pankreas bud daha önce karakterize; ataları Pdx1, Sox9, Ptf...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro at JoVE.com

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

9.0K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Gelişim Biyolojisi

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

Pluripotent Verimli Farklılaşma NKX6-1 için Kök Hücreler<sup&gt; +</sup&gt; Pankreas Progenitörler

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Biyomühendislik

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Adacık Kümelerine Farklılaşması

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biyoloji

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler