Araştırma Spagnoli lab. Helmholtz Topluluğu, FP7-IRG-2008-ENDOPANC hibe ve ERC-2009-Başlangıç ​​HEPATOPANCREATIC Grant tarafından finanse edilmektedir.

Burada açıklanan protokol başlangıçta Percival ve Bolluk 9 açıklanan ve konfokal mikroskopi için optimize tekniği adapte edilmiştir. 1. Glass Bottom Kültür Yemekleri Kaplama Aşağıdaki adımları bir laminar akış başlık steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. <ol><li> Pankreas eksplantları 20-mm çaplı cam mikro alt (örneğin Mattek Corporation) ile 35 mm Petri kapları içinde kültüre. Eksplant kültür başına ve kültürün tüm süresi için bir cam alt tabak kullanın. Pankreas tomurcukları, ceket fibronektin ile cam alt mikro diseksiyonu ve öncesi izolasyon gününde. </li><li> 50 ug / ml nihai konsantrasyonuna kadar hücre kültürü kaliteli su içinde steril fibronektin seyreltilir ve bütün cam yüzeyi (Şekil 1E) kapsayan Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine, en az miktarda (~ 150 ul) ilave edin. Bulaşıkları yerleştirinizgecelik inkübasyon için 4 ° C&#39;de buzdolabında. </li><li> Diseksiyon gününde, fibronektin aspire hücre kültürü dereceli su ile mikro durulayın ve BME 150 ul (Bazal Orta Eagle) Kalem / Strep (% 1), Glutamin (% 1 ile desteklenmiş orta minimum hacim ekleme ) ve 50 mg / ml gentamisin [Diseksiyon Orta]. Plaka eksplantlar hazır olana kadar laminer akış kaputu kaplı yemekleri bırakın. </li></ol> Tüm fibronektin kaplı yemekler kullanılırsa, bunlar 4 ° C&#39;de 1 hafta kadar saklanabilir Yemekleri, kuru Dissection Orta ile doldurun ve buzdolabında koyun izin vermeyin. Fibronektin ek olarak, pankreas eksplantlar başarılı bir şekilde bu gibi laminin 9, Matrigel 10,11 veya 12 mikro-gözenekli membran gibi çeşitli yüzeyler üzerinde kültive edilmiştir. Çünkü dallanma üzerindeki etkileri, biz substrat olarak fibronektin 9 kullanın. 2. D DiseksiyonE11.5 gelen orsal Pankreas Bud - E12.5 Fare Embriyolar <ol><li> Embriyonik gün (E) 11.5 veya 12.5 Zamanlı gebe dişi fareler kurban ve embriyolar önceden% 70 Etanol ile temizlenmelidir diseksiyon aletleri kullanılarak toplanmıştır. 50 ug / ml gentamisin ile takviye buz gibi soğuk PBS içeren 10 cm&#39;lik bir levha halinde parçalara rahim yerleştirin. </li><li> Yavaşça desidua çevrili uzak rahim kas ve bireysel embriyolar kaldırmak, soyulma, küçük makas veya Dumont forseps kullanarak bireysel embriyo segmentleri içine yukarıdaki ayrı rahim aydınlatmaya sahip bir stereomikroskopta altında. Embriyolar maruz ve yolk kesesi ve amniyon kaldırmak için 13 standart embriyo diseksiyon teknikleri kullanın. Daha sonra, embriyonun üst vücut (karaciğer yukarıda) ve kuyruk bölgesi çıkarın. Bu iç organlar (Şekil 1B) maruz sağlayacaktır. Buz BME diseksiyon orta içeren 10 cm tabak içine embriyo orta gövde aktarın. </li><li> Şimdigörselleştirmek ve stereomikroskop altında dorsal pankreatik tomurcuk incelemek için aşağıda sadece transillüminasyon kullanın. Yavaşça, forseps ile lateral kesi yaparak embriyonun orta gövde açın. Mide ve dalak bulun. Dorsal pankreatik bud midenin arka bölgesi (Şekil 1C) yanal olarak eklenir. Dumont forseps kullanarak, örneğin mide ve dalak gibi komşu yapıları, gelen dorsal pankreatik bud uzaklıkta teşrih, ama (Şekil 1D) epiteli çevresindeki bazı mezenşimi bırakarak. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak,% 10 fetal buzağı serumu [Kültür Orta] ile takviye soğuk BME diseksiyon orta içeren bir 35 mm Petri kabı içine izole tomurcuk aktarın. Tüm pancreata izole edilene kadar bu adımları tekrarlayın. Farklı genotiplerin pancreata izole edilir, bunları Nunc 4-kuyucuğu kullanarak ayrı tutmak. </li></ol> 3. Pankreas Eksplantlarından arasında Kaplama ve Kültür Nihai plateksplant kültürleri ing fiziksel hareketini en aza indirmek için doku kültür odası ve / veya doku kültürü kuluçka makinesi yakın olarak gerçekleştirilir. <ol><li> Bir laminer akış kaputu steril koşullar altında BME kültür ortamı ~ 150 ul fibronektin kaplı Mattek yemekler 37 önceden ısıtılmış ° C. BME Diseksiyon Orta değiştirin </li><li> Dikkatlice, bir cam Pasteur pipeti kullanarak uzun süreli kültür için kaplamalı Mattek yemekleri (çanak başına bir eksplant) içine pankreas eksplantlar aktarın. Kültür esnasında yayma temin etmek için, eksplantlar çevreleyen hafifçe mezenşim ince bir iğne ile, gerekirse, yırtık olabilir. </li><li> Yavaşça, bir doku kültürü inkübatör kültürleri yerleştirin (37 ° C;% 5 CO 2) eksplantlar cam alt mikro eklemek izin birkaç saat için. Bir kez onlar önceden ısıtılmış 37 SEA kültür ortamı 1.5 ml 2 ml Mattek yemekleri doldurmak °, ekli C. Disseksiyon gün 0. gün olarak ifade edilir. </li><li> ManPankreatik eksplant kültürleri ipulation bir laminar akış başlık içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Deneysel gereksinimleri farklı zamanlama (kimyasal ajanlarla eksplant örneğin inkübasyon) dikte sürece BME kültür ortamı, her gün değiştirilir. Eksplantları bir hafta ila 5 gün için bu durum içinde yetiştirilebilir. </li></ol> 4. Pankreas Eksplantlarından için Tüm montaj İmmünofloresan Boyama Protokolü Immünofloresan protokolünün tüm adımları (fiksasyon görüntülemeye) bir plastik dipli çanak daha iyi görüntü verir, aynı Mattek çanak yürütülmektedir. Tespit edildikten sonra, pankreas eksplant kültürleri steril koşullar altında tutulması gerekmez. <ol><li> BME kültür ortamı aspire ve 2 ml 1X PBS ile bir kere eksplant yıkayın. </li><li> Eksplant fiksasyon için 2 ml buz-soğuk% 4 paraformaldehid (PFA) ile PBS değiştirin ve 20 dakika buz üzerinde çanak yerleştirin. Zaman levha Girdap yavaşçazaman, ama eksplant ayırmak olabilir gibi, sallanan platformlar kaçının. </li><li> PFA çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika her biri için 1X 2 ml PBS ile eksplant üç kez yıkayın. </li><li> 2 ml engelleme çözeltisi ile blok (1X PBS +% 0.1 Triton-X +% 3 eşek Serum) oda sıcaklığında en az 30 dak. </li><li> Çözelti, blokaj birincil antikor ile seyreltilir ve 4 gece boyunca inkübasyon için eksplant bütün yüzeyi kaplayan ° C. Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine direkt olarak seyreltme ~ 150 ul ekle , Fiziksel hareketleri minimize doğrudan soğuk oda (4 ° C) eksplantlar primer antikor eklemek için. Buharlaşmanın önlenmesi için, antikor eklemeden önce, nemli bir odaya Mattek plakaları yerleştirin. </li><li> Ertesi gün antikor çözeltisi kaldırmak ve 2 ml 1X PBS ile üç kez yıkama +% 0.1 Tween-20 ile oda sıcaklığında 30 dakika her biri için (PBT). </li><li> Çözümü engelleme ikincil antikor sulandırınız [üretici tavsiyelerine göre, biz eşeği Alexa Fluor boyalar ikincil önleyici kullanın1:750 seyreltme] ve karanlıkta oda sıcaklığında, 1-2 saat inkübasyon için, bütün yüzeyi kaplayan eksplant Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine, doğrudan doğruya seyreltme ~ 150 ul eklemek de organları. Nükleer counterstaining için, ikincil antikor seyreltme ile birlikte Hoechst içerir. Buharlaşmanın önlenmesi için, antikor eklemeden önce, nemli bir odaya Mattek plakaları yerleştirin. </li><li> 2 ml 1X PBS ile üç kez yıkanır +% 0.1 30 dakika için oda sıcaklığında her bir Tween-20 (PBT). </li><li> Monte etmeden önce, Tween-20 kaldırmak için 1X PBS ile bir kez yıkayın. Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine monte sulu ortam, bir damla (anti-solma ile) ilave edilerek monte edin. Yavaşça, bir cam lamel ile eksplant kapsamaktadır. Hava kabarcıkları kaçının. </li><li> Mattek plakaları Eksplantlarından deney hedeflerine bağlı olarak, standart faz kontrast mikroskobu veya konfokal mikroskopi altında görülebilir. Konfokal mikroskopi analizi için bir Zeiss LSM 700 ters ayarını kullanın. Bizi floroforlar uygun lazerler ayarlamaed. Objektif bir seçim bu olacak görüntü pankreas eksplant istediğiniz alanı. 10X bir su-daldırma objektif görüş alanının tamamını eksplant tutmak için uygundur. A 40X su veya yağ-immersiyon hedefleri daha fazla çözünürlüğe sahip pankreas eksplant belirli bölgelerine odaklanmak için uygundur. Eksplantları optik kesit ve sonra edinilen Z yığınları uygun bir yazılım kullanarak, 3D yeniden olabilir. </li></ol> 5. Pankreas Eksplantlarından Canlı hücre Görüntüleme Protokolü <ol><li> Çevre odası kurulumu: bir çevre muhafaza ve küçük bir inkübasyon odası kullanımı mikroskop sahne üzerine oturur [Sıcaklık ve CO 2 kontrolü ile]. Embriyonik pankreas Özgün kültür 37 ° C ve nemlendirilmiş% 5 CO 2 bir atmosfer kontrollü bir sabit sıcaklık gerektirir. Uygun odaları çeşitli satıcılar mevcuttur (Örneğin, Zeiss, Nikon, Olympus). Isıtıcı kutusunda birleştirin ve üzerine açıngörüntüleme önce t en az 1 saat ekipmanları ısınmak ve% 5 CO 2 içeriğini denge için izin başlar. </li><li> Pankreas eksplant kültür time-lapse görüntüleme için, biz bir Zeiss LSM 700 inverted mikroskop kullanın. Lazerler ve objektif seçimi için noktası 4.10. </li><li> Pankreas eksplant canlı görüntüleme başlamadan önce iyice alt kısmı cam tabak eklemek edelim. [Biz genellikle canlı görüntüleme 1. Gün başlayan gerçekleştirmek]. Bir laminer akış kaputu, aspirat ve optimum besin koşulları ile başlamak taze BME besiyeri ile eksplant orta değiştirin. </li><li> Yavaşça mikroskop odasına eksplantlar aktarın ve konfokal mikroskop numune tutucu içine kuluçka odasında Mattek çanak yerleştirin. </li><li> Nesnel hazırlayın (örneğin immersiyon objektif seçimi uygun yağ veya su-orta ekleyin) ve eksplant ilgi bölgeye odaklanır. Çevre bölmesi düzgün şekilde kapatın. Time-lapse sırasında buharlaşma önlemek içinsu yerine su daldırma hedefleri ile edinimi, bu (örneğin Zeiss İmmersol B) piyasada bulunmaktadır viskoz immersiyon sıvıları kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Lazer yoğunluğu, Z-yığını toplama parametreleri ve zaman aralığı (Sorun Giderme için de Tartışma bakınız) ayarlayın. Denemeyi başlatın. </li><li> Görüntüleme, ihracat Z yığınları ve tüm zaman noktalarında sonra ve uygun yazılımlar (örneğin ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens) kullanarak onları analiz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Dorsal pankreas tomurcukları (birlikte çevredeki mezenşimi ile) E11.5 ve E12.5 ve doğrudan cam alt kültür kaplarına (Şekil 1) kaplamalı arasındaki fare embriyoları diseke edildi. Kan damarları epiteli çevreleyen mezenşimi bulunan ve endotelyal işaretleyici Pecam 12 (veriler gösterilmemiştir) için immünboyama ile görülebilmesi. Kültür, pankreas eksplantlar und iki gün sonraönemli bir büyüme erwent ve kimin çekirdekleri pankreas transkripsiyon faktörü pozitif olan dallı epitelyal yapılar, Pdx1 (Şekil 2A-C) kendilerini organize etmeye başladı. Kültürün 3. gününde pankreas eksplant ortalama z kalınlığı 60-80 mikron olduğunu. Eksplant yüzeyi ve hacmi uygun yazılım programları (örn. Huygens) kullanılarak ölçülebilir. Morfoloji ve immünofloresan analizleri pankreas eksplantlar in vivo erken pankreas farklılaşma ve morfogenetik olaylar 5,10,11,14 (Şekil 2) değinmeyecek bu protokolü kullanarak kültürlü olduğunu gösterdi. Kültürünün 4. günde Pankreas eksplantlar tipik &quot;ucu ve gövde&quot; cpa1 gösteren epitelin 8 segregasyon, + Bagajındaki kümeleri olarak organize epitel dalları (Şekil 2C) ve farklılaştırılmış insülin + ve glukagon + hücrelerinin uçları progenitör hücreler (Şekil 2B yapıldı ). Buna ek olarak, pancreatiex vivo kültürlerde c epiteli bazal membran (kırmızı Şekil 2E,) az apikal F-aktin lokalizasyonu (Şekil 2E, yeşil) ve b1-integrin ile, uygun hücre iskeleti organizasyon ve hücre polarite gösterdi. (; Fare zorlanma Jackson Laboratuvarı mevcuttur mT / mG) (Şekil 3) gerçek zamanlı olarak dallanma pankreas incelemek için, embriyonik pankreas eksplantlar çift renkli flüoresan raportör fare zorlanma membrane-Tomato/membrane-Green 15 izole edildi. Yine kültür içinde yetiştirilir mT / mg pankreas eksplant bir süre hızlandırılmış film kareler Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Membran yapıları mT floresan protein lokalizasyonu hücre morfolojisi özetliyor ve zamanla hücre yenileme ve göç izlemek sağlayan, ince hücresel süreçleri çözünürlük sağlar. 12 saat time-lapse deneyden sonra mT floresans sinyali uygun ve dete kalırctable, yoğunluğu büyük olasılıkla fotohasar nedeniyle (Şekil 3), azalmış olsa bile. Fotohasar ve fototoksisite önlemek veya azaltmak için teknik çözümler Tartışma bölümünde ele alınmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Şekil 1. E12.5 fare embryo gelen dorsal pankreas tomurcuğu diseksiyon şematik gösterimi. E12.5 fare embriyo (A) aydınlık görüntü. Embriyo (karaciğer yukarıda) ve kuyruk bölgenin üst vücut orta gövde (B) ayırmak için kaldırılır. Kesikler kırmızı noktalı çizgilerle gösterilir. Mide ve onikiparmak bağırsağı bölgenin pozlama (noktalı kutu ile gösterilir) (C) Ek diseksiyon sonuçları. Dorsal pankreatik bud (kırmızı noktalı bir daire bakın) mide ve dalak primordium&#39;un yanında dibinde olduğunu. Disseke dorsal pankreatik bud (D) BME kültür ortamı içeren bir cam alt yemeğin Mikro (E içine bir Pasteur pipeti ile aktarılır, F). Kısaltmalar: sto (mide), sp (dalak), dp (dorsal pankreatik tomurcuk), ikili (duodenum). Ölçek çubuklar, 1000 um (A, C). <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Şekil 2. Pankreas eksplant kültürleri Tüm montaj konfokal immünofloresan analizi. 1. gün ve ex vivo kültür günde 2 pankreatik eksplant (A) aydınlık görüntüler. Kırmızı noktalı çizgi epitelin dallanma başlatılması gösterir. Bütün montaj (B) 3D rekonstrüksiyon gün 3 pankreas kültür Pdx1 için immünboyama. Pankreas eksplant kültür 48 hr tarafından kapsamlı dallanma geçiren Pdx1 + hücrelerinin tübül gösterdi. Bazolateral membran işaretleyici E-kaderin (ECAD), ucu progenitör marker, karboksipeptidaz 1 (Cpa1) ve fosfor-Histon H3 (pHH3) karşı antikorlar ile günde 3 pankreatik eksplant (C) Tüm montaj immün. Etkin mitotik pHH3 + hücrelerin çoğu Cpa1 + hücreleri ile periferik ipuçları colocalize. Kesik lines dal ucu göstermektedir. Endokrin soy belirteçler, insülin (Ins) ve 3. günde glukagon (Gluca) için (D) Tüm montaj immün. Sarı ok İnş kümeler + ve Gluca + hücreleri gösterir. Ankastre (D &#39;), endokrin hücresi kümesinin bir yüksek-büyütme. Pdx1, β1 integrin (β1int) ve F-aktin (Fact) için günde 3 pankreatik eksplant (E) Tüm montaj immün. Pdx1-pozitif epitel hücreleri arasında serpiştirilmiş Mezenkimal hücreler (yıldız). C, D, ve E de gösterilen Görüntü Z-dizi tek konfokal optik kesitlerdir. Ölçek çubuklar, 100 um (A, B), 50 um (CE). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Şekil 3. Ex vivo kültüre pankreas eksplant Temsilcisi canlı hücre görüntüleme. Bir mT / mG fare transgenik embriyo bir pankreas eksplant bir time-lapse film (MS) Çerçeveler. Dakika görüntüleme süre saat cinsinden gösterilmiştir. Eksplant Gün 1 başlayarak görüntülendi. Z-yığın görüntüleri40X yağ immersiyon objektif 15 saat olmak üzere toplam her 12 dk ile elde edildi. Kesik çizgiler epitel ve mezenşimi arasındaki şube ve sınırın ucu belirtin. Ölçek çubuğu, 50 mikron.

<ol>
	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Pankreas kaderi belirtildiğinde sonra, pankreas progenitör hücreler sonunda olgun ve fonksiyonel bir organdır 2,4 oluşturmak için kapsamlı çoğalma, farklılaşma ve morfonogenezi tabi. Şu anda, dallanma nasıl pankreas yer alır ve nasıl progenitör çoğalması ve farklılaşması bağlı büyük ölçüde bilinmemektedir. Pankreas eksplant kültürleri bu süreçlerin ex vivo 5,9,11 aydınlatmak için ideal bir sistem temsil eder. Erken pankreas tomurcukları ex vivo ...

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Antikorlar: Karboksipeptidaz E-kaderin F-aktin Glukagon Ensülin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Fosfo-Histon H3 </td><td> Abd Serotec Invitrogen Molecular Probes Immunostar Millipore Millipore Abcam Hibridoma bankası Hücre Sinyal </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Bazal Orta Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Steril koşullar altında muhafaza </td></tr><tr><td> Hücre kültürü dereceli su </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Steril koşullar altında muhafaza </td></tr><tr><td> Kültür yemekleri (cam tabanlı), 35 mm </td><td> Mattek Corporation, </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Eşek Serum </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml&#39;lik </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu Altın </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Steril koşullar altında muhafaza </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Stok sol. Hücre kültürü dereceli su içinde 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Steril koşullar altında muhafaza </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Steril koşullar altında muhafaza </td></tr><tr><td> 4-iyi Multidishes </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskoplar: Ters Konfokal Mikroskop (LSM 700) Stereomikroskopta (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Amaç: C-Apochromat 0.45 / 10X W M27 (işparçası dist 1.8 mm;. Görüntüleme derinliği ~ 100 mm); C-Apochromat 1,2 W Corr M27 (işparçası dist 0.28 mm.; ~ Görüntüleme derinliği 50 mikron) / 40X Yukarıda ve aşağıda fiber optik aydınlatma dan transillüminasyon </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Roth </td><td> 0335.3 </td><td> Stok solüsyonu% 20 </td></tr><tr><td> Pasteur Pipet (Cam), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Steril c tutulanonditions </td></tr><tr><td> Petri kapları, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Petri kapları, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS pH7.4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Steril koşullar altında muhafaza </td></tr><tr><td> Bahar Makas 8 mm bıçak kavisli </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> Saatçi foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

Pankreas sindirim enzimleri ve kan şekeri düzeylerini 1 düzenlenmesi üretimi dahil olmak üzere vücudun hayati fonksiyonları kontrol eder. Geçtiğimiz on yıl içinde birçok çalışma pankreas organogenez anlamak için sağlam bir temel katkıda bulunmuş olsa da, önemli boşluklar erken pankreas oluşumu 2 bilgimizi devam etmektedir. Bu erken olayların tam bir anlayış bu organın gelişimini içgörü sağlayabilir, ama aynı zamanda, diyabet veya pankreas kanseri gibi pankreas hedef tedavi edilemez hastalıklar, girer. Son olarak, bu bilgi diyabet kapsamında hücre-değiştirme tedavileri geliştirmek için bir şablon oluşturur. Embriyo oluşumu sırasında, pankreas embriyonik gün dorsal ve ventral foregut endodermal fare embriyo 3,4 (E) 9,5 farklı embriyonik çıkıntılar meydana gelmektedir. Hem çıkıntılar sağlam epitel olarak çevredeki mezenşimi içine tersyüz etmektam olgun organı 2,5,6 oluşturmak için dallanma ve farklılaşması, proliferasyonu geçmesi l tomurcukları. Son bulgular insülin üreten β-hücreleri dahil olmak üzere pankreas hücre soylarının, büyüme ve farklılaşma dallanma pankreas epiteli 7,8 içinde uygun doku mimarisi, epitel şekillenmesi ve hücre konumlandırma bağlıdır ileri sürmüşlerdir. Ancak, morfolojilerinden dallanma nasıl oluşur ve pankreasta proliferasyon ve farklılaşma ile koordine edilir ölçüde bilinmemektedir. Bu morfogenetik olaylar son derece dinamik ise bu gelişim süreçleri hakkında güncel bilgi, sabit numunelerinin analizi neredeyse sadece güvendi olması nedeniyle kısmen olduğunu. Burada, diseksiyon ve gelişmekte olan pankreas (Şekil 1) doğrudan görüntülenmesine izin cam alt yemekleri hakkında kültürleme fare embriyonik pankreas tomurcukları ex vivo için bir yöntem sunulmuştur. Bu külture sistemi ideal Özellikle, canlı hücre görüntüleme, konfokal lazer tarama mikroskopi için tasarlanmış ve. Pankreatik eksplantlar, sadece yabani-tip fare embriyolarından hazırlanmış, fakat, aynı zamanda genetik mühendisliği fare suşu (örneğin, transgenik veya nakavt) için, mutant fenotipleri gerçek zamanlı çalışmalar sağlayan edilebilir. Dahası, bu ex vivo kültür sistemi çoğalması ve büyümesi, uzama, dallanma, tubulogenesis ve farklılaşması ile ilgili nicel veriler elde etmek sağlayan, pankreas gelişimi üzerinde kimyasal bileşiklerin etkilerini incelemek için değerlidir. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile kombine bir ex vivo pankreas eksplant kültür yöntemi geliştirilmesi de gelişmekte olan fare embryo içinde meydana gibi morfogenetik ve farklılaşma olayları gözlemlemek için güçlü bir platform sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas at JoVE.com

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir temsil<em&gt; Ex vivo</emMorfolojilerinden, farklılaşma ve büyüme gibi pankreas gelişiminin çeşitli yönlerini incelemek için&gt; sistemi. Pankreatik tomurcuk eksplantlar birkaç gün boyunca kültürlendi ve bütün monte immunofloresans ve canlı görüntüleme de dahil olmak üzere farklı uygulama, bir dizi içinde kullanılabilir.

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

a-system-for-ex-vivo-culturing-of-embryonic-pancreas

Research

JoVE Journal

Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.6K Görüntüleme.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir temsil Ex vivo sistemi. Pankreatik tomurcuk eksplantlar birkaç gün boyunca kültürlendi ve bütün monte immunofloresans ve canlı görüntüleme de dahil olmak üzere farklı uygulama, bir dizi içinde kullanılabilir.

Video: A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...