Bu yöntem kronik lenfositik lösemi alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, hastaların doğru prognoz gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı basit, hızlı ve son derece doğru olmasıdır. Bu tekniğin etkileri sağlam prognostikasyona doğru uzanır, özellikle kronik lenfositik lösemi hastaları ile risk sertifikaları doğru çünkü doğru prognostikasyon daha sonra hastalığın terapötik yönetimini tanımlayabilir.
PcR ürün seçimi ve özet dizi çözümleme türleri hem hassasiyet hem de deneyim gerektirdiğinden öğrenmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Bu prosedürü başlatmak için, 50 mililitre steril toplama tüpüne 200 mikrolitre EDTA ekleyin. Tüp ve pipet yukarı ve aşağı 2-3 kez karıştırmak için tüp ve pipet 20 mililitre ve RPMI orta 15 mililitre ekleyin.
Daha sonra, yeni bir 50 mililitre toplama tüpüne 15 mililitre yoğunluk gradyan ortam ekleyin. Periferik kan çözeltisini yoğunluk gradyan ortamına yavaşça katlayın, degradeyi bozmayan dan emin olun. Santrifüj freni kapalı 20 dakika boyunca 800 kez G santrifüj.
Sonra üst plazma trombosit tabakası ve yoğunluk gradyan orta tabaka arasında oluşan mononükleer hücre halkatoplamak ve yeni bir steril 15 mililitre toplama tüpü ne aktarım steril bir Pasteur pipet kullanın. Son hacmi 12 mililitre ve pipet çözeltiyukarı ve aşağı karıştırmak için olduğu gibi RPMI orta ekleyin. 8 dakika boyunca 800 kez G'de santrifüj.
Supernatant atın ve RPMI orta 10 mililitre ile hücre pelet yeniden askıya. 8 dakika boyunca 750 kez G'de tekrar santrifüj. Bundan sonra, supernatant atın ve PBS bir mililitre hücre pelet eritin.
Yeni bir Bauer plakası kullanarak, 20 mikrolitre numune ve 80 mikrolitre 1-10 Türk çözeltisini karıştırarak hücre sayısı oluşturur. Numunenin akış aşağı işleme aynı gün için zamanlanmış değilse, sekiz dakika boyunca 750 kez G'de numuneyi santrifüj edin. Supernatant atın ve eksi 80 santigrat derece hücre pelet saklayın.
İlk olarak, tarafsız amplifikasyon sağlamak için her alt grup astar equimolar miktarları kullanarak astar karışımı hazırlayın. METIN protokolünün ikinci tablosunda listelenen PCR reaktiflerini karıştırın. Karışık PCR reaktifleri içeren PCR tüpüne 0,5 mikrolitre TAP polimeraz ekleyin.
Daha sonra, 100 nanogram gDNA veya iki mikrolitre cDNA ekleyin. Metin protokolünün üçüncü tablosunda ayrıntılı olarak termal PCR protokolünü çalıştırın. Bundan sonra, IGHPFR1 astar karışımlarını kullanırken IGHV litre astarları veya 350 baz çifti kullanırken yaklaşık 500 baz çifti PCR ürünleri için kontrol edin.
PCR ürün arınmaya başlamak için, PCR ürününün toplam hacmini %3'lük düşük eriyen agarose jelüzerine yükleyin. PCR ürünlerinin arka plandan ayrılana kadar jel üzerinde çalışmasına izin verin. Keskin belirgin PCR bantları excise ve daha sonra arındırmak ve onları elite.
İki yeniden düzenleme algılanırsa, her iki bant da ayrı ayrı çıkarılmalı ve sıralanmalıdır. Exo-sap temizleme gerçekleştirmek için, kullanılacak belirli hacimlerle ilgili üreticinin yönergelerini izleyin. Her numuneyi 30 dakika boyunca 37 derecede bir PCR bloğunda karıştırmak ve kuluçkaya yatırmak için her numuneyi yavaşça girdaplayın.
Enzimleri 15 dakika boyunca 85 santigrat dereceye Kadar ısıtarak etkisiz hale getirin. Bundan sonra, ürünün saflığını değerlendirmek için pcr ürünlerinin küçük bir miktarını yüzde üç agarose jelüzerine yükleyin. Sıralamadan önceki son denetim noktası, parça çözümlemesi kullanarak numunenin klonalitesini belirlemektir.
Sırayı çözümlemeye başlamak için uygun yazılımı başlatın. Homo sapiens gibi türleri ve reseptör tipini veya lokusu belirtin. Fasta formatında analiz edilecek ve metin alanına tanımlayıcıları da dahil olmak üzere, her çalışma başına en fazla 50 dizilik gruplar halinde analiz edilecek dizileri hızlandırın.
Ardından, sonuçlar için aşağıdaki üç görüntüleme seçeneğinden birini seçin. Ayrıntılı görünüm:her dizinin sonuçlarını tek tek almak için bu seçeneği seçin. Sentez görünümü:IGHV geni ve alel adı veya sıragiriş sırası ile sıralanmış bir özet tablosu derlemek için bu seçeneği seçin.
Bu seçenek ayrıca, gönderilen herhangi bir toplu iş aynı IGHV geni ve alel ve son olarak, Excel dosyasına atanan dizilerin bir hizalama sağlar. Tüm çıktı dosyalarını tek bir dosyaya dahil edilmiş elektronik tablolar olarak sağlamak için bu seçeneği belirleyin. Sadece IGHV litre astarkullanımı yeniden düzenlenmiş IGHV tam uzunluğu amplifikasyon sağlar, böylece gerçek HSM yük belirlenmesiiçin izin.
Beklenen PCR ürünü yaklaşık 500 baz çiftidir. IGHV litre astarların clonotipic IG yeniden düzenlenmesini yükseltemediği nadir durumlarda, IGHBFR1 astarları kullanılabilir. Beklenen PCR ürünü yaklaşık 350 baz çiftidir.
Elde edilen diziler daha sonra IMG TV Quest aracı kullanılarak analiz edilir. Sonuçlar tablosundaki ilk satır, IG yeniden düzenlenmiş bir sıra üretken veya verimsiz olabileceğinden, dizinin işlevselliğini belirtir. Bir IGH gen rearrangement verimsiz dir stop kodonları VDJ bölge içinde mevcut ve / veya yeniden düzenleme eklemeler / silme nedeniyle çerçeve dışında ise.
Sadece verimli ve dolayısıyla işlevsel düzenlemelerin daha fazla analiz edilmesi gerektiğini belirtmek önemlidir. Varsayılan IMG TV Quest parametreleri kullanılırken, eklemeler ve silmeler otomatik olarak algılanmaz, ancak bir dizinin bu tür değişiklikleri taşıyabilen güçlü göstergeler araç tarafından sağlanır ve sonuç özet tablosunun altında bir uyarı uyarısı görüntülenir. Bu yordamı denerken, klonal bağ çokklonal arka plan dan ayırt edilebilir, böylece jel yeterince uzun PCR ürünleri arazi hatırlamak önemlidir.
Bu teknik, gelişiminden sonra kronik lenfositik lösemi immünogenetik alanında araştırmacıların hastalarda somatik epimutasyon durumunun prognostik etkisini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Etilyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kaputun altında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
