Name: in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

Nitya Jain bir NIH/NIAID kariyer geçiş Ödülü 1K22AI116661-01 tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan yordamları ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Massachusetts General Hospital onayı ile gerçekleştirilmiştir.
Dikkat: Bu protokol bir sınıf 3b lazer (LG3) kullanımını gerektirir. LG3 lazer koruyucu gözlük her zaman bu lazer çalışırken kullanılması gerekir. Yaralanma riskini önlemek için uygun eğitim ve güvenlik yönergelere uyulmalıdır.
1. tasarım ve lazer montajı
<ol><li>Işık yayan diyot (LED) bağlanmak (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fiber birleştiğinde) LED sürücü üzerinden için LED için gelir 4 pinli M8 bağlantı kablosu bağlı. Dikkatli bir şekilde bağlantı tutturmak için sıkıştırın.</li>
	<li>Optogenetics bağlantı kablosu için LED eklemeden önce bağlayıcı tutun LED kadar açılış orada emin olmak için ışık görünür hiçbir engel vardır. Eğer gerekli herhangi bir engelleri ortadan kaldırmak ve optogenetics bağlantı kablosu ataşını delik üfle.</li>
	<li>Fiber optik kanül kanül bağlayıcı kol bir ucunu ekleyerek optogenetics bağlantı kablosu bağlayın. Bağlayıcı kol diğer ucunu bağlantı kablosu takın.  Güvenli bağlantı ama değil viraj veya fiber optik kanül kırmak için dikkatli olmak için yeterli basınç uygulayın. Not: her ne zaman lazer kullanmak değildir kırılgan fiber optik kanül koruyucu başlığı ile kaplıdır.</li>
	<li>LED sürücü 0 ile 1.2 A. ayarlanmış geçerli sınırı sürekli ayar düğmesi ile sürekli dalga (CW) moduna ayarla</li>
</ol>2. Photoconversion iki nokta üst üste hücrelerinin
Not: Erkek ve dişi fareler intracolonic 405 nm ışık için 1-2 gün sonra kendi Doğum maruz kaldılar ve yaş 1 hafta önce kurban edildi.
<ol><li>Karanlık bir yerde bir elektrik prizine bir erişim ile güvenli. LED sürücü sokunuz. Not: ortam ışığı farelerin uzun bir pozlama istenmeyen bir photoconversion hücrelerinin neden olabilir gibi bu yordamı en az beyaz ışık içinde gerçekleştirilir. Kırmızı ışık alternatif olarak kullanılır. Dikkat: Aşağıdaki adımı bir hayvan anestezik kullanımını gerektirir. Anestezi Yönetimi Sınıf II başlıklı veya başka bir uygun atma sistemi kullanılarak gerçekleşir. İnhalasyon anestezi baş dönmesi, uyuşukluk veya hatta bilinç kaybı neden olabilir.</li>
	<li>4-%5 isoflurane % 100 O2 bir indüksiyon kutusunda maruz fare anestezi. Uygun anestezi derinliği sıkıca arka pençe (cevap yok) pinching tarafından doğrulayın. Anestezi burun konisi, yaklaşık % 2 isoflurane üzerinden korumak. İşleyici isoflurane bir uygun başlık veya anestezik atma aygıt kullanımı ile etkilenmemek.</li>
	<li>İntracolonic maruz imzalat fare scruff fare arkası için 1 el yavaşça işaret parmağı ve başparmak ile kullanarak yerleştirin. Karın ortaya çıkarmak için fareyi çevirin. Fare pembe rengini kaybetmeye başlar yoksa onun solunum hızı yavaş başlar kavrama gevşetin. Fare kuyruğu halka ve küçük parmaklar arasındaki güvenli.</li>
	<li>Diğer elini de koruyucu başlığı kanül kaldırın. Süre paraca desteklemek fare orta hat için paralel kanül uzun ekseninin hafifçe yerleştirin fiber optik kanül anüs yoluyla kolon böylece tüm 5 mm Fiber optik fare içinde. Not: Bu yordam yavaş yavaş ve kolon duvar sorgulamaktı değil özenle yapılır. Kıpır kıpır ve kanül büküm dakika içine kolon ilerleme yardımcı olur.</li>
	<li>Koruyucu gözlük don ve maksimum değerine (sonuna kadar saat yönünde) geçerli lazer artırmak. UV ışık varlığı fare karın yarı saydam bakarak onaylayın. Not: LG3 lazer koruyucu gözlük görünürlüğünü önemli ölçüde azaltır. Var bir meslektaşım (giyiyor koruyucu donanım) gözlük donning ve yardımcı üzerine lazer dönüm.</li>
	<li>2 dk. geri kanül yaklaşık 1 mm toplam lazer ışığı kolona her 30 maruz ışığa maruz luminal alanı en üst düzeye çıkarmak için s. Lazer 2 dk sonunda devre dışı.</li>
	<li>Yavaş yavaş kanül fare kaldırın. Anestezi boş bir sıcak kafeste üzerinden geri aldıktan sonra fare ev kafese geri.</li>
</ol>3. yalıtım bağırsak lenfositler
<ol><li>Hank'in dengeli tuz çözüm/buzağı serum (HBSS/CS) arabelleği 1 L, epitel şerit arabellek 200 mL, 500 mL yıkama medya ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 200 mL hazırlamak-ücretsiz yıkama medya. Not: Reaktif birimleri 9 Örneklem büyüklüğü için hesaplanır.<ol>
<li>HBSS/CS tampon (HBSS; %5 CS) HBSS için 950 mL 50 mL CS ekleyerek getirin. Onu buza saklayın.</li>
		<li>[HBSS; %5 CS; 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES) (pH 7.2-7,5)] epitel şerit arabellek için 185 mL CS, 1 M DTT, 0,5 M EDTA 2 mL ve 1 M HEPES tampon 3 mL 200 µL 10 mL ekleyerek hazırlamak HBSS. 37 ° C su banyosu epitel şerit arabellekte bir yer.</li>
		<li>(HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA) yıkama medya CS 5 mL ve 1 mL 0.5 M EDTA HBSS 494 mL için ekleyerek getirin. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>EDTA içermeyen yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 15 mM HEPES) 195 mL HBSS 2 mL CS ve 3 mL 1 m HEPES ekleyerek hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Bir FACS tampon yapmak [1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x (pH 7.2 =); % 2 CS] CS 10 mL PBS için 490 mL ekleyerek. Onu buza saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku toplama yemek bir 70 µm hücre süzgeç bir 60 x 10 mm Kültür çanak koyarak hazırlamak. Yemek için HBSS/CS tampon (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) 10 mL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Fare ile inhale isoflurane uygun anestezi atma işlemini kullanarak aşırı dozda ötenazi (yaklaşık 3 dk Riziko > % 4 isoflurane Oda hava veya %100 O2). Sonra belirgin nefes kesilmesi ve refleks hareketi, derin ağrı yokluğu sıkıca bir arka pençe pinching tarafından doğrulayın (forseps kullanarak önerilir). Ötenazi ile cerrahi makas ya da yeni bir usturanın kullanarak bir işten çıkarma emin olun. Not: Servikal yerinden çıkması boyutu ve hayvan yaş nedeniyle bu adım için tavsiye edilmez. Bu yöntemler üzerinde ötenazi 2013 travma yönergeleri ile tutarlı olduğundan ve MGH IACUC tarafından onaylandı.</li>
	<li>Karın açmak için temiz forseps ve makas kullanarak kolon hasat. Bağırsak kolon ortaya çıkarmak için fare karın 1 tarafına yansıtır. İlk o (doğru anüs) sadece distal transecting tarafından tüm kolon kaldırmak çekum için. Sonra iki nokta üst üste forseps ile sıkıca açgözlü iken, makas üretra Rectuma kesmek için kullanın. Anüs mümkün olduğunca yakın olarak kolon kesme. Dalak Kolonu çıkardıktan sonra hasat (bkz: 4.1-4.2 aşağıdaki adımlar). Not: photoconversion iletişim kuralı yalnızca ~ % 25 yenidoğan'ın kolon (fiber optik kanül 5 mm) hedefleyen iken, tüm kolon hücre yalıtım modunda yardım için hasat edilir.</li>
	<li>İki nokta üst üste iki nokta üst üste ve kuru kağıt havlu üzerine içeriğini itmek için forseps kullanarak temizleyin. Doku ince bir kültür yemek kapağında bir hamur içine iki nokta üst üste doğrayın ve bu hamur hücre süzgeç Petri kabına aktarmak için jilet kullanarak lunaparkçı.</li>
	<li>Temiz 8 mm uzun manyetik heyecan çubuğu için süzgeç ekleme ve çanak 9-pozisyon manyetik karıştırıcı tabağa yerleştirin. Manyetik heyecan bar hızını ayarlamak için 800 devir/dakika ve oda sıcaklığında 5 min için hücreleri kuluçkaya. Arabellek atın ve 10 mL HBSS/CS (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) kullanarak yıkama yineleyin. Arabellek yıkama sonunda atmak.</li>
	<li>Epitel hücreleri prewarmed epitel şerit arabellek (HBSS % 5 CS 1 mM DTT; 5 mM EDTA; 3.1.2 adımda yapılan ve 37 ° C su banyosu içinde depolanmış 15 mM HEPES [pH 7.2-7,5] arabellek) 10 mL ekleyerek hücre süzgeç ayırmak ve 30 dk içinde 3 için 800 rpm'de karıştırın 7 ° C inkübatör. İnkübasyon sonunda, epitel kesir bir temiz 15 mL tüp için zenginleştirilmiş arabellek aktarın. Not: sağlam lamina propria hücrelerde hücre süzgeç sırasında bu adım11kalırken epitel ve ilişkili hücreleri (bağırsak epitel hücreleri ve bağırsak epitel lenfositler) arabelleği serbest.<ol>
<li>Zenginleştirilmiş Bağırsak epitel kesir (IELs) vasıl 700 x g için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet FACS arabellek 1 mL resuspend. Kullanılmak üzere adım 3,15 buzda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>2 hücre süzgeç içinde lamina propria kesir yıkama x HBSS/CS ile. Bunu yapmak için 10 mL HBSS/CS çözeltisi (HBSS; buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapıldı % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.</li>
	<li>Örnek 2 yıkama yıkama medya x. Yıkama medya (HBSS; % 1 CS; adım 3.1.3 ve oda sıcaklığında depolanmış 1 mM EDTA arabellek) 10 mL hücre süzgeç ekleyin ve 15 dakika 37 ° C kuluçka 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.<ol>
<li>Yıkama medya kullandıktan sonra adım 3.14 kullanımda buzda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Örnek 2 yıkama x HBSS ile/CS. 10 mL HBSS/CS tampon (HBSS; buz üzerinde depolanan 3.1.1. adımda yapılan % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.</li>
	<li>EDTA içermeyen yıkama arabellek dokusunda kuluçkaya. 10 mL EDTA içermeyen yıkama arabellek (HBSS; % 1 CS; 3.1.4. adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanmış 15 mM HEPES tampon) hücre süzgeç ekleyin ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 10 dakika plaka kuluçkaya. Bu adımın sonundaki arabellek atmak.</li>
	<li>Örnek 2 yıkama x HBSS/CS ile ve enzim çözüm hazırlamak. HBSS/CS (HBSS; % 5 CS arabellek buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapılan) 10 mL ekleyin arabellek hücre süzgeç ve 10 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.<ol>
<li>Enzim çözüm hazırlamak (EDTA içermeyen yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 167 mg/mL collagenase) ikinci yıkama süresi boyunca: 9 mg eklemek DNaz ben ve 15 mg liyofilize collagenase 90 mL EDTA ücretsiz için arabellek yıkayın. Çözüm, oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria lenfositler (LPLs) elde etmek için hücre süzgeç bulunan lamina propria kesir sindirmek. Enzim çözüm 10 mL ekleyin (EDTA ücretsiz yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 3.12.1 adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanan 167 mg/mL collagenase arabellek) hücre süzgeç için ve 45 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın. Not: LPLs sonra enzimatik sindirim çözüm içine salınır.<ol>
<li>Hücreleri içeren enzim çözüm toplamak ve 50 mL konik tüp içine yeni bir hücre süzgeç aracılığıyla filtre.</li>
	</ol></li>
	<li>20 mL soğuk yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA made ın adım 3.1.3 ve saklı 3.9.1. adımda buzda arabellek) enzim çözüm collagenase faaliyetleri engellemek için filtre uygulanmış hücreleri ekleyin. Tüp vasıl 700 x g oda sıcaklığında 6 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve LPLs 1 mL FACS arabellek içeren pelet resuspend.</li>
	<li>IEL (Kimden adım 3.7.1) ve lipoprotein LİPAZ (Kimden adım 3.14) kesirler birleştirir ve onları floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5). Not: bölme bilgi isterseniz IEL ve lipoprotein LİPAZ kesirler ayrı ayrı lekeli.</li>
</ol>4. yalıtım lenfositleri dalak üzerinden
<ol><li>Toplama tüp microcentrifuge tüp içine 500 µL FACS arabelleği ekleyerek hazırlayın. Onu buza saklayın.</li>
	<li>İki nokta üst üste (adım 3.4) kaldırma sonra bütün dalak hasat ve toplama tüpü yerleştirin. Doku buz üstünde depolar.</li>
	<li>Bir elektrik doku homogenizer kullanarak, dalak yaklaşık 1 dk. santrifüj microcentrifuge tüp içinde 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek lunaparkçı.</li>
	<li>Kırmızı kan hücre lizis 500 µL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis arabelleği hücre ölümü tarafından ozmotik lizis başlatmak için örnek resuspending tarafından gerçekleştirin. Örnek 1-2 dk oda sıcaklığında kuluçkaya ve sonra FACS arabellek 725 µL içinde resuspend izin.</li>
	<li>300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Pelet FACS arabellek 500 µL içinde resuspend ve yeni microcentrifuge tüp içine 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Tüm örnek için yeni bir microcentrifuge tüp aktarmak ve floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5).</li>
</ol>5. Dendra-r+ hücreleri kullanarak akış sitometresi tanımlaması
<ol><li>300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de IEL/LPL ve dalak örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Granül mix boyama antikor 100 µL içinde resuspend. Mix 1 µL fluorescently Birleşik anti-CD45 antikor FACS arabelleği örnek başına 100 µL ekleyerek boyama antikor hazırlayın. Not: Deneme önce akış sitometresi için en uygun konsantrasyonu belirlemek için Doygunluk bağlama oluştuğu kullanılan antikor titre önemlidir.</li>
	<li>Örnekleri (karanlık bir konumda) buz üzerinde 35 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Örnekleri FACS arabellek 300 µL içinde resuspend ve onları vasıl 300 x g [mikro santrifüj] için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve örnekleri FACS arabellek 325 µL içinde resuspend. Akış Sitometresi örneği analiz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system.">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li><li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+the+Microbiome+on+Type+1+Diabetes.">The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes.</a> Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).</li><li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+autoimmune+disease:+the+hosted+self.">Microbiota and autoimmune disease: the hosted self.</a> Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).</li><li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+Newborn+and+Young+Infant+from+Infectious+Diseases:+Lessons+from+Immune+Ontogeny.">Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny.</a> Immunity. 46, 350-363 (2017).</li><li>Jain, N., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+host-microbial+crosstalk+in+postnatal+intestinal+immune+homeostasis.">Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis.</a> Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).</li><li>Macpherson, A. J., Uhr, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protective+IgA+by+intestinal+dendritic+cells+carrying+commensal+bacteria.">Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria.</a> Science. 303, 1662-1665 (2004).</li><li>Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+basis+of+tolerance+and+immunity+to+intestinal+antigens.">Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens.</a> Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).</li><li>Diehl, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+restricts+trafficking+of+bacteria+to+mesenteric+lymph+nodes+by+CX(3)CR1(hi)+cells.">Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells.</a> Nature. 494 (3), 116-120 (2013).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li><li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation.">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li><li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii.">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li><li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells.">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li><li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut.">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kimlik ve çalışabileceği ve bağırsaktaki microbiota etkilenmiştir hücrelerin karakterizasyonu önemlidir ve mukozal microenvironment bilgilerinden vücudun geri kalanına nasıl geçirilir anlayış kolaylaştıracaktır. Gut ile ilgili hücre geçiş çalışmak için bir yöntem yalıtımı gut ilişkili hücre tarafından evlat edinen bir transfer alıcı fareler onların doku-posta desenlerini belirlemek ve12,13işlev takip gerektirir. Aktarılan beli...

Memeli gastrointestinal sistem ana makine1ile simbiyotik bir ilişki bulunmaktadır bakteri türleri yüzlerce liman. Yerel ortamda mevcut bağışıklık hücreleri ile bu mikropların barışçıl kullanımını zorlayın ve patojen akınları karşı koruyucu bir bariyer oluşturmak. Böylece, bağışıklık hücreleri ve microbiota arasındaki çift yönlü etkileşimler ana bağışıklık sistemi eğitir ve patojenler için bağışıklık reaktivite eşiğini ayarlar komensal bir topluluk kurmak için kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal kompozisyon veya dysbiosis, can değişimler bağışıklık homeostazı rahatsız ve huzursuz bağırsak iltihapları2,3 tip 1 diyabet ve IBD gibi hastalıklar immün aracılı önde gelen dizginlemek düzenleyici devreler .
Sonra hemen Doğum sırasında aynı zamanda bağışıklık sistemini kurmak bağırsak mikrobiyal topluluklar başlar benzersiz bir gelişimsel pencere dönemi4olgunlaşır. Postnatal microbiota istikrarlı, vardiyalar halinde doğal olarak meydana gelen topluluk kompozisyon ve sık sık5ile değil. İki farklı anatomik konumda bağırsak - lamina propria ve bağırsak epitel6microbiota ile etkileşim bağışıklık hücreleri bulunur. Çeşitli tiplerde bağışıklık hücreleri lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve doğuştan gelen lenfoid hücre gibi) (hangi katmak dendritik hücreler, monosit ve makrofajlar) myeloid hücrelerin yanı sıra dahil bağırsak, mevcut. Bu hücreler, olarak da bilinen hematopoetik hücreler, çok sayıda bağırsak bariyer korumak ve homeostazı korumak işlevler gerçekleştirin.
Bağırsak siteleri kendi düzenleyici işlevlerine ek olarak, mukoza bağışıklık hücreleri sistemik dokunulmazlık7,8,9düzenleyen mikrobiyal iletileri ekstra bağırsak sitelere de taşıyabilir. Bu araştırma ilgi alanıdır ve onların işlevini prob için bağırsak dokusu dışında geçirmek bağışıklık hücreleri tanımlamak yöntemleri ihtiyacını vurgular. Rapor burada protokol photoconvertible floresan protein etiket hücrelere istismar edilir bir ticari olarak mevcut fare modeli kullanır. PhAMeksize fareler ubiquitously ultraviyole (UV) ışık10tarafından geri dönüşümsüz etkinleştirme üzerine kırmızı floresans için açık yeşil bir floresan Dendra2 protein hızlı. Yeni doğan farelerin kolon 405 nm ışık sağlamak için fiber optik kanül kullanarak, kaynaklı veya kolon aktarıldığı photoconverted hematopoetik hücreler, dalak bulunabilir göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Laser&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetics patch cable</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optic cannula</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &amp;micro;m and an inner diameter of 480 &amp;micro;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 laser safety goggles&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Red light&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intestinal cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Micro magnetic stir bar</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single cell suspension&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homogenizer tips&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

Enterik bakteri toplulukları erken yaşta kurulur ve bağışıklık hücre gelişimi ve işlevini etkiler. Yenidoğan microbiota antibiyotik kullanımı ve diyet, otoimmün ve inflamatuvar hastalıklara yatkınlık etkileri de dahil olmak üzere çok sayıda dış etkilere maruz kalabilir. Bozuklukları inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi bağırsak için bağışıklık hücreleri büyük akını ile karakterizedir. Ancak, bağışıklık hücreleri tarafından microbiota şartına ayrıca bağışıklık yanıtı ekstra bağırsak sitelerdeki etkilemek için bağırsaklar dışarı göç. Böylece, tanımlamak ve bağırsak mikrobiyal iletilerden distal sitelere taşıyabilir hücreleri ayırdetmek için gerek yoktur. Burada, ekstra bağırsak sitelerde kimlik geçişten sonra sağlar yeni doğan fareler vivo içinde kolon etiket hücrelere bir yöntem açıklanmaktadır.

Bir fiber optik kablo 405 nm ışık iki nokta üst üsteeksize 2 - gün eski PhAM farelerin teslim etmek için kullanıldı. Önceki deneyler, 30 s maruz kalma en az sitotoksisite (Şekil 1A) ile iki nokta üst üste hücre maksimal photoconversion vermek tespit edilmiştir. Bu nedenle, sıralı 30 s Etkilenmeler kolon farklı kesimlerinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi yapılmıştır. Lazer pozlama, fareler hemen eut...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Burada açıklanan protokol photolabeling yaklaşım yeni doğan farelerde özellikle kolon ekstra bağırsak sitelere göç bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanır. Bu stratejinin ana bilgisayar-microbiome erken hayat etkileşimlerde eğitim yararlı olacaktır.

Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

in-vivo-photolabeling-cells-colon-to-assess-migratory-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Burada açıklanan protokol photolabeling yaklaşım yeni doğan farelerde özellikle kolon ekstra bağırsak sitelere göç bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanır. Bu stratejinin ana bilgisayar-microbiome erken hayat etkileşimlerde eğitim yararlı olacaktır.

Video: In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Gelişim Biyolojisi

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Kullanımı<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme Yenidoğanlar Deneysel Fare Sitomegalovirüs Enfeksiyon ilerleme Monitör

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Kanser Araştırmaları

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Fare Retinal Sirkülasyonunda Akış Dinamikleri Çalışmak İçin Eritrositler ve Lökositlerin Floresan Boya Etiketlenmesi

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Tıp

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler