Name: in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

Nitya Jain fue apoyada por un premio de transición de carrera de NIH/NIAID 1K22AI116661-01.

Animales todos los procedimientos fueron realizados con la aprobación de y de acuerdo con el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Hospital General de Massachusetts.
PRECAUCIÓN: Este protocolo implica el uso de un láser de clase 3b (LG3). LG3 gafas láser siempre deben utilizarse al utilizar este láser. Deben seguirse las directrices apropiadas de capacitación y seguridad para evitar el riesgo de lesiones.
1. diseño y montaje de láser
<ol><li>Conecte el diodo electroluminoso (LED) (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, fibra) para el controlador de LED vía el cable de conector M8 de 4 pines que viene conectado al LED. Con cuidado apriete el tornillo para fijar la conexión.</li>
	<li>Antes de conectar el cable de parche optogenetics al LED, sujete el conector de no apertura del LED a la luz para asegurarse de que están obstrucciones visibles. Golpe en el hoyo para eliminar obstrucciones e inserte el cable de parche optogenetics en la abertura.</li>
	<li>Conectar la cánula de fibra óptica a cable del remiendo optogenetics insertando la cánula en cada extremo de la funda del conector. Conecte el otro extremo de la funda del conector para el cable de interconexión.  Aplicar suficiente presión para asegurar la conexión pero tenga cuidado de no doblar o romper la fibra óptica en la cánula. Nota: La cánula de frágil de la fibra óptica está cubierta con el capuchón protector cada vez que el láser no está en uso.</li>
	<li>Configurar el controlador de LED al modo de onda continua (CW) con la perilla de ajuste continuo en 0 y el límite actual establecido a 1,2 A.</li>
</ol>2. Photoconversion de las células en el Colon
Nota: Ratones machos y hembras fueron expuestas a la intracolonic 405 nm luz 1-2 días después de su nacimiento y se sacrificaban antes de 1 semana de edad.
<ol><li>Fije un lugar obscuro con un acceso a una toma de corriente. Conecte el conductor del LED en la salida. Nota: Este procedimiento se realiza en la mínima luz blanca ya que una larga exposición de los ratones a la luz ambiental puede causar un photoconversion no deseado de las células. La luz roja se utiliza como una alternativa. PRECAUCIÓN: El siguiente paso implica el uso de un anestésico animal. La administración de la anestesia lleva a cabo en una campana de clase II o mediante otro sistema de depuración adecuado. La inhalación de la anestesia puede causar mareos, somnolencia o incluso pérdida del conocimiento.</li>
	<li>Anestesiar el ratón por la exposición a 4-5% de isoflurano en 100% O2 en una caja de inducción. Verificar la adecuada profundidad de la anestesia firmemente pellizcando una pata trasera (sin respuesta). Mantener anestesia mediante un cono de nariz en aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar la exposición de controlador al isoflurano por uso de una adecuada campana o dispositivo de depuración anestésico.</li>
	<li>Coloque el ratón anestesiado para la exposición de intracolonic con 1 mano al pescuezo la parte posterior del ratón suavemente con el dedo índice y el pulgar. Poner el mouse al exponer el abdomen. Afloje la empuñadura si el ratón comienza a perder su color rosa o si su tasa de respiración comienza a disminuir. Asegure la cola del ratón entre el anillo y los pequeños dedos.</li>
	<li>Con la otra mano, retire la tapa protectora de la cánula. Manteniendo el eje longitudinal de la cánula paralela a la línea media del ratón, inserte suavemente la cánula de fibra óptica a través del ano en el colon para que todos los 5 mm de la fibra óptica están dentro del ratón. Nota: Este procedimiento se realiza lentamente y con cuidado de no perforar la pared colónica. Minutos moviendo y girando de la cánula del SIDA el adelanto en el colon.</li>
	<li>Ponga las gafas de seguridad y aumentar el láser actual hasta el valor máximo (completamente hacia la derecha). Mirando el abdomen traslúcido del ratón para confirmar la presencia de luz ultravioleta. Nota: Las gafas de seguridad de láser LG3 disminuyen considerablemente la visibilidad. Con un colega (usar equipo protector) ayudar a ponerse las gafas y encender el láser.</li>
	<li>Exponer los dos puntos a la luz del láser para un total de 2 minutos retirar la cánula de aproximadamente 1 mm cada 30 s para maximizar el área luminal expuesto a la luz. Al final de 2 minutos, apague el láser.</li>
	<li>Lentamente retire la cánula del ratón. Después de recuperarse de la anestesia en una jaula caliente vacía, devolver el ratón a la estructura de la casa.</li>
</ol>3. aislamiento de los linfocitos intestinales
<ol><li>Preparar 1 L de tampón de la madeja sal equilibrada solución/becerro suero (HBSS/CS), 200 mL de tampón de la franja epitelial, 500 mL de medio de lavado y 200 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA)-libre de los medios de lavado. Nota: Los volúmenes de reactivo se calculan un tamaño de muestra de 9.<ol>
<li>Hacer el tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS) mediante la adición de 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Guárdelo en hielo.</li>
		<li>Preparar la memoria intermedia de la franja epitelial [HBSS; 5% CS 1 mM Ditiotreitol (DTT), EDTA 5 mM; mM 15 4-(2-Hydroxyethyl) piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (HEPES) (pH 7.2-7.5)] añadiendo 10 mL de CS, 200 μL de TDT, 2 mL de EDTA de 0,5 M y 3 mL de tampón de HEPES de 1 M 1 M y 185 mL de HBSS. Colocar el buffer de la franja epitelial en un baño de agua de 37 ° C.</li>
		<li>Hacer los medios de lavado (HBSS; % 1 CS y 1 mM EDTA) añadiendo 5 mL de CS y 1 mL de EDTA de 0.5 M a 494 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar los medios de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES) añadiendo 2 mL de CS y 3 mL de 1 M HEPES y 195 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Hacer un tampón FACS [1 x de tampón fosfato salino (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] añadiendo 10 mL de CS y 490 mL de PBS. Guárdelo en hielo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar el plato de la colección de tejido mediante la colocación de un filtro de célula 70 μm dentro de una placa de cultivo de 60 x 10 mm. Añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo) al plato y coloque en el hielo.</li>
	<li>Eutanasia el ratón a través de una sobredosis de isoflurano inhalado mediante compactación adecuada de anestésico (una exposición de min aproximadamente 3 a > 4% de isoflurano en el aire o en el 100% O2). Después de la aparente cesación de la respiración y reflejo movimiento, verificar la ausencia de dolor profundo firmemente pellizcando una pata trasera (se recomienda usar pinzas). Asegúrese de que la eutanasia a través de una decapitación con un par de tijeras quirúrgicas o una nueva maquinilla de afeitar recta. Nota: La dislocación Cervical no se recomienda para este paso debido al tamaño y edad del animal. Estos métodos son consistentes con las pautas de AVMA de 2013 sobre la eutanasia y aprobaron por el IACUC MGH.</li>
	<li>La cosecha del colon con pinzas limpias y tijeras para abrir el abdomen. Reflejan los intestinos a 1 lado del abdomen del ratón para exponer los dos puntos. Quitar el colon entero por primera transecting lo apenas distal (hacia el ano) para el ciego. Luego, mientras agarra con firmeza el colon con pinzas, use tijeras para cortar a través de la uretra al recto. Corte del colon como cerca del ano como sea posible. Cosecha el bazo después de quitar los dos puntos (véase los pasos 4.1-4.2 más abajo). Nota: Mientras que el protocolo de photoconversion sólo objetivos de ~ 25% de puntos del recién nacido (5 mm de la cánula de fibra óptica), se cosecha todo el colon para ayudar en el aislamiento de células.</li>
	<li>Limpiar el colon mediante el uso de fórceps para empujar el contenido de los dos puntos y en una toalla de papel seca. Homogeneizar el tejido mediante el uso de hojas de afeitar para picar el colon en una goma en la cubierta de una placa de cultivo y luego transferir la pasta a la coladera del celular en la caja Petri.</li>
	<li>Agregar una barra de agitación magnética durante mucho tiempo de limpieza 8 mm a la coladera y coloque el plato en un plato agitador magnético de 9 posiciones. Ajustar la velocidad de la barra de agitación magnética a 800 rpm e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el búfer y repetir el lavado con 10 mL de HBSS/CS (la HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo). Deseche el búfer al final del lavado.</li>
	<li>Disociar las células epiteliales mediante la adición de 10 mL de tampón de la franja epitelial precalentado (la HBSS; 5% CS 1mM TDT, 5mM EDTA; buffer HEPES [pH 7.2-7.5] de 15mM que se hizo en el paso 3.1.2 y almacenado en un baño de agua de 37 ° C) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 30 min en un 3 7 ° C la incubadora. Al final de la incubación, transferir el búfer enriquecido en la fracción epitelial a un tubo limpio de 15 mL. Nota: El epitelio y las células asociadas (intestinales células epiteliales y los linfocitos epiteliales intestinales) son liberadas en el buffer, mientras que las células en el intacto propria de la lámina quedan en el colador de la célula durante este paso11.<ol>
<li>Centrifugar la fracción epitelial intestinal enriquecida (IELs) 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón FACS. Almacenar en el hielo para su uso en el paso 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave la fracción de lámina propia dentro de la coladera de la célula 2 x con HBSS/CS. Para ello, añadir 10 mL de solución de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% que se hizo en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.</li>
	<li>Lavar la muestra 2 x en medios de lavado. Añadir 10 mL de medio de lavado (HBSS; 1% CS y tampón de EDTA 1 mM que se hizo en el paso 3.1.3 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 15 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.<ol>
<li>Después de usar los medios de lavado, tienda en el hielo para el uso en paso 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar la muestra 2 x con HBSS CS añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS almacenador intermediario en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.</li>
	<li>Incubar el tejido en tampón de lavado libre de EDTA. Añadir 10 mL de tampón de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS y 15 mM de tampón HEPES con que fue hecha en el paso 3.1.4 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula e incubar la placa por 10 min a temperatura ambiente sin revolver. Deseche el búfer al final de este paso.</li>
	<li>Lavar la muestra 2 x con HBSS/CS y prepare la solución de enzima. Añadir 10 mL de HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) de búfer a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 10 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.<ol>
<li>Preparar la solución de enzima (EDTA libre lavado Tampón; 0,1 mg/mL DNasa I; colagenasa 167 mg/mL) durante el segundo período de lavado: Añadir 9 mg de DNasa I y 15 mg de liofilizado colagenasa a 90 mL de EDTA tapón de lavaje. Almacenar la solución a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Digerir la fracción de lámina propia contenida en el filtro de la célula para obtener linfocitos de lámina propia (LPLs). Añadir 10 mL de la solución de enzima (el EDTA libre tampón de lavado; 0,1 mg/mL DNasa I; 167 mg/mL de tampón de colagenasa en paso 3.12.1 y almacenados a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 45 minutos en una incubadora de 37 ° C. Nota: LPLs se liberan en la solución después de la digestión enzimática.<ol>
<li>Recoger la solución de enzima que contiene las células y filtrar con un filtro nuevo de celular en un tubo cónico de 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Añadir 20 mL de medio de lavado fría (la HBSS; CS 1%, EDTA 1mM tampón hecho en paso 3.1.3 y almacenados en hielo en el paso 3.9.1) a las células de filtrado para bloquear la actividad de la colagenasa en la solución de enzima. Centrifugar el tubo a 700 x g durante 6 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene LPLs en 1 mL de tampón FACS.</li>
	<li>Combinar la IEL (del paso 3.7.1) y las fracciones de la LPL (del paso 3.14) y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5). Nota: IEL y LPL fracciones pueden ser manchados por separado si se desea información del compartimiento.</li>
</ol>4. aislamiento de linfocitos de bazo
<ol><li>Preparar el tubo de la colección agregando 500 μl de tampón FACS en un tubo de microcentrífuga. Almacenar en el hielo.</li>
	<li>Después de quitar los dos puntos (paso 3.4), cosecha del bazo entero y colocarlo en el tubo de la colección. Guarde el tejido en el hielo.</li>
	<li>Utilizando un homogenizador de tejido eléctrico, homogeneizar el bazo en un tubo de microcentrífuga durante aproximadamente 1 minuto centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante.</li>
	<li>Realizar la lisis de glóbulos rojos por Resuspender la muestra de 500 μl de tampón de lisis (ACK) de amonio cloruro de potasio para iniciar la muerte celular por lisis osmótica. Permita que la muestra Incubar 1-2 min a temperatura ambiente y luego lo resuspender en 725 μl de tampón FACS.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 500 μl de tampón FACS y filtrar a través de un tamiz de 40 μm células en un tubo nuevo de microcentrífuga. Transferir toda la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5).</li>
</ol>5. identificación de Dendra-r+ citometría de flujo utilizando las células
<ol><li>Centrifugar las muestras a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante IEL/LPL y del bazo.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 100 μl de mezcla de la coloración del anticuerpo. Preparar el anticuerpo coloración mezcla añadiendo 1 μl de anticuerpo anti-CD45 conjugado fluorescente a 100 μl de tampón FACS por muestra. Nota: Es importante valorar los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo antes del experimento para determinar la concentración óptima donde se produce la saturación de enlace.</li>
	<li>Incubar las muestras durante 35 min en hielo (en un lugar obscuro).</li>
	<li>Resuspender las muestras en 300 μL de tampón FACS y centrifugar a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 325 μl de tampón FACS. Analizar las muestras en un citómetro de flujo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system.">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li><li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+the+Microbiome+on+Type+1+Diabetes.">The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes.</a> Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).</li><li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+autoimmune+disease:+the+hosted+self.">Microbiota and autoimmune disease: the hosted self.</a> Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).</li><li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+Newborn+and+Young+Infant+from+Infectious+Diseases:+Lessons+from+Immune+Ontogeny.">Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny.</a> Immunity. 46, 350-363 (2017).</li><li>Jain, N., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+host-microbial+crosstalk+in+postnatal+intestinal+immune+homeostasis.">Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis.</a> Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).</li><li>Macpherson, A. J., Uhr, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protective+IgA+by+intestinal+dendritic+cells+carrying+commensal+bacteria.">Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria.</a> Science. 303, 1662-1665 (2004).</li><li>Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+basis+of+tolerance+and+immunity+to+intestinal+antigens.">Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens.</a> Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).</li><li>Diehl, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+restricts+trafficking+of+bacteria+to+mesenteric+lymph+nodes+by+CX(3)CR1(hi)+cells.">Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells.</a> Nature. 494 (3), 116-120 (2013).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li><li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation.">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li><li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii.">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li><li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells.">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li><li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut.">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La identificación y caracterización de células que interactúan con y son influenciados por la microbiota del colon son importantes y deben facilitar la comprensión de cómo información del microambiente de la mucosa se transmitió al resto del cuerpo. Un método para estudiar la migración de células de intestino requiere el aislamiento de las células asociadas con tripa, seguida de una transferencia adoptiva en ratones receptores para determinar sus patrones de tejido-autoguiado hacia el blanco y función<sup cl...

El tracto gastrointestinal de mamífero alberga cientos de especies de bacterias que existen en una relación simbiótica con el huésped1. Las células inmunes presentes en el medio local hacer una convivencia con estos microbios y establecen una barrera protectora contra invasiones de patógeno. Así, las interacciones bidireccionales entre las células inmunes y la microbiota son críticas para establecer una comunidad de comensal que educa el sistema inmunológico del host y establece el umbral de reactividad inmune a los patógenos. Cambios en la microbiana composición, o disbiosis, pueden perturban la homeostasis inmune y perturban circuitos regulatorios que frenen inflamaciones intestinales llevando a enfermedades inmune-mediadas tales como Diabetes tipo 1 y enfermedad inflamatoria intestinal2,3 .
El período inmediatamente después del nacimiento una única ventana del desarrollo durante el cual las comunidades microbianas intestinales comienzan a establecer al mismo tiempo el sistema inmune madura4. La microbiota postnatal no es estable, con cambios en la composición de la comunidad que ocurren naturalmente y con frecuencia5. Las células inmunes que interaccionan con la microbiota residen en dos localizaciones anatómicas distintas en el intestino - la lámina propia y el epitelio intestinal6. Numerosos tipos de células inmunes están presentes en el intestino, incluyendo los linfocitos (como células T, células B y células linfoides innatas) así como de las células mieloides (que incluyen macrófagos, monocitos y células dendríticas). Estas células, también conocido como células hematopoyéticas, realizan multitud de funciones que preservar la barrera intestinal y mantener la homeostasis.
Además de sus funciones de reguladoras en intestinal, las células inmunes de la mucosa también pueden llevar mensajes microbianos a los sitios extra intestinales regular inmunidad sistémica7,8,9. Esto es un área de creciente interés en la investigación y pone de relieve la necesidad de métodos identificar las células inmunes que migran fuera del tejido intestinal con el fin de sondear su función. El protocolo reportado aquí utiliza un modelo de ratón disponibles en el mercado donde una proteína fluorescente photoconvertible se explota a las células de etiqueta. Ubicuo, PhAMsuprimido ratones expresan una proteína verde fluorescente Dendra2 que esté irreversiblemente fluorescencia roja después de la activación por luz de ultravioleta (UV)10. Utilizando una cánula de fibra óptica para proporcionar luz de 405 nanómetro en el colon de ratones recién nacidos, demostramos que las células hematopoyéticas photoconverted, que originó adentro o tránsito por el colon pueden encontrarse en el bazo.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Laser&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetics patch cable</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optic cannula</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &amp;micro;m and an inner diameter of 480 &amp;micro;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 laser safety goggles&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Red light&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intestinal cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Micro magnetic stir bar</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single cell suspension&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homogenizer tips&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

Comunidades bacterianas entéricas se establecen temprano en la vida e influyen en la función y desarrollo de las células inmunes. La microbiota neonatal es susceptible a numerosas influencias externas, incluyendo el uso de antibióticos y dieta, que afecta la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Trastornos como enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) se caracterizan por una afluencia masiva de las células inmunes a los intestinos. Sin embargo, las células inmunológicas condicionadas por la microbiota además pueden emigrar fuera de los intestinos para influir en las respuestas inmunitarias en sitios extraintestinales. Por lo tanto, es necesario identificar y caracterizar las células que lleven mensajes microbianos de los intestinos a sitios distales. Aquí, describimos un método para células de etiqueta en el colon de ratones recién nacidos en vivo que permite su identificación en sitios extra intestinales después de la migración.

Un cable de fibra óptica fue utilizado para entregar luz de 405 nanómetro en los dos puntos de los 2 días de edad PhAMsuprimido ratones. En experimentos anteriores, una exposición de s 30 determinó dar una photoconversion máxima de células de colon con la citotoxicidad mínima (figura 1A). Por lo tanto, alternativamente 30 exposiciones de s de los diferentes segmentos del colon se llevaron a cabo como se describe en el proto...

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

El protocolo descrito aquí utiliza un enfoque photolabeling en ratones recién nacidos para identificar específicamente las células inmunes que emigran desde el colon a sitios extraintestinales. Esta estrategia será útil para estudiar las interacciones host microbioma en primeros años de vida.

En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

in-vivo-photolabeling-cells-colon-to-assess-migratory-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K vistas.  Massachusetts General Hospital. El protocolo descrito aquí utiliza un enfoque photolabeling en ratones recién nacidos para identificar específicamente las células inmunes que emigran desde el colon a sitios extraintestinales. Esta estrategia será útil para estudiar las interacciones host microbioma en primeros años de vida.

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A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biología

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

El uso de<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Inmunología e Infección

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Investigación sobre el cáncer

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Etiquetado de colorantes fluorescentes de eritrocitos y leucocitos para estudiar la dinámica de flujo en la circulación de la retina del ratón

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Medicina

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales

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