Name: in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

Nitya Junior foi apoiado por um prêmio de transição de carreira NIAID/NIH 1K22AI116661-01.

Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) no Hospital Geral de Massachusetts.
Atenção: Este protocolo envolve o uso de um laser de classe 3b (LG3). Óculos de segurança do laser de LG3 sempre devem ser usados quando este laser em funcionamento. Orientações adequadas de treinamento e segurança devem ser seguidas para evitar o risco de lesões.
1. projeto e montagem de Laser
<ol><li>Se conectar o diodo emissor de luz (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fibra-acoplado) para o LED driver via o cabo conector M8 de 4 pinos que vem anexado para o LED. Com cuidado, aperte o parafuso para fixar a conexão.</li>
	<li>Antes de fixar o cabo de remendo de optogenetics o LED, segure o conector não abertura do LED para a luz para assegurar-se lá são nenhuma obstrução visível. Sopre o furo para eliminar obstruções, se necessário e insira o cabo de remendo de optogenetics na abertura.</li>
	<li>Conecte a cânula de fibra óptica do cabo de remendo de optogenetics por inserir a cânula em cada extremidade da manga do conector. Fixe a outra extremidade da manga do conector para o cabo de remendo.  Aplica pressão suficiente para garantir a conexão, mas tenha cuidado para não dobrar ou quebrar a fibra óptica da cânula. Nota: A cânula de frágil da fibra óptica é coberta com a tampa de protecção sempre que o laser não está em uso.</li>
	<li>Definir o driver de LED para o modo de onda contínua (CW) com o botão de ajuste contínuo em 0 e o limite atual definido como 1.2 A.</li>
</ol>2. Photoconversion de células do cólon
Nota: Ratos machos e fêmeas foram expostos à intracolonic 405 nm luz 1-2 dia (s) após o seu nascimento e sacrificaram-se antes de 1 semana de idade.
<ol><li>Assegurar um local escuro, com um acesso a uma tomada elétrica. O driver de LED ficha eléctrica. Nota: Este procedimento é realizado na luz branca mínima como uma longa exposição dos ratos a luz ambiente pode causar um indesejado photoconversion das células. Luz vermelha é usada como uma alternativa. Atenção: O passo seguinte envolve o uso de um anestésico de animal. A administração do anestésico tem lugar em um bairro de classe II ou usando outro sistema de eliminação adequado. A inalação de anestésico pode causar tonturas, sonolência ou até mesmo inconsciência.</li>
	<li>Anestesia o mouse pela exposição aos 4-5% de isoflurano em 100% de O2 em uma caixa de indução. Verificar a profundidade apropriada da anestesia beliscando firmemente uma pata traseira (sem resposta). Manter a anestesia através de um cone de nariz em aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar a exposição de manipulador de isoflurano pelo uso de um dispositivo de eliminação anestésico ou capuz adequado.</li>
	<li>Posicione o mouse anestesiado para a exposição de intracolonic usando 1 mão à nuca, as costas do mouse suavemente com o dedo indicador e o polegar. Vire o mouse para expor o abdome. Solte o punho se o rato começa a perder sua cor-de-rosa ou se sua taxa de respiração começa a desacelerar. Prenda o rabo do mouse entre o anel e os dedos pequenos.</li>
	<li>Com a outra mão, retire a capa protetora da cânula. Mantendo o longo eixo da cânula paralela à linha mediana do rato, Introduza cuidadosamente a cânula de fibra óptica através do ânus para o cólon para que todos os 5 mm da fibra óptica são dentro do mouse. Nota: Este procedimento é realizado lentamente e com cuidado para não perfurar a parede do cólon. Minuto se mexer e torção da cânula auxilia o avanço para o cólon.</li>
	<li>Não os óculos de segurança e aumentar a laser atual para o valor máximo (todo o caminho no sentido horário). Confirme a presença da luz UV de olhar para o abdômen translúcido do mouse. Nota: Os óculos de segurança do laser LG3 dramaticamente diminuem a visibilidade. Tenho um colega (usando equipamentos de proteção) auxiliar na acoplando os óculos e ligar o laser.</li>
	<li>Expor o cólon para a luz do laser para um total de 2 min. retirar a cânula de aproximadamente 1 mm a cada 30 s para maximizar a área luminal exposta à luz. No final de 2 min, desligue o laser.</li>
	<li>Remova lentamente a cânula do mouse. Depois de se recuperar da anestesia em uma gaiola vazia quente, retorne o rato da gaiola em casa.</li>
</ol>3. isolamento de linfócitos Intestinal
<ol><li>Preparar 1 L de tampão de soro (HBSS/CS) solução equilibrada sal/bezerro do Hank, 200 mL de tampão epitelial tira, 500 mL de mídia de lavagem e 200 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-lavagem de mídia livre. Nota: Os volumes de reagente são calculados para um tamanho de amostra de 9.<ol>
<li>Fazer o buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) adicionando-se 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Armazená-lo no gelo.</li>
		<li>Preparar o buffer tira epiteliais [HBSS; 5% CS 1 mM ditiotreitol (DTT); 5 mM EDTA; ácido de piperazina-1-etanesulfónico 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) (HEPES) (pH 7,2-7,5)], adicionando 10 mL de CS, 200 µ l de 1 M DTT, 2 mL de EDTA 0,5 M e 3 mL de tampão HEPES de 1m para 185 mL de HBSS. Coloca o tampão tira epiteliais em banho maria a 37 ° C.</li>
		<li>Fazer a mídia de lavagem (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) adicionando-se 5 mL de CS e 1 mL de EDTA 0,5 M a 494 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.</li>
		<li>Prepare a mídia de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES), adicionando 2 mL de CS e 3 mL de 1 M HEPES a 195 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.</li>
		<li>Fazer uma reserva de FACS [1 x salina tamponada fosfato (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] adicionando 10 mL de CS a 490 mL de PBS. Armazená-lo no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o prato de coleção de tecidos, colocando um filtro de célula 70 µm dentro de um prato de cultura 60 x 10 mm. Adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo) para o prato e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Eutanásia o rato através de uma overdose de isoflurano inalado usando a eliminação adequada de anestésico (aproximadamente 3 min exposição a > 4% de isoflurano no ar ambiente ou em 100% O2). Após a aparente cessação da respiração e reflex movimento, verificar a ausência de dor profunda por beliscar firmemente uma pata traseira (usar fórceps é recomendado). Certifique-se a eutanásia através de uma decapitação usando um par de tesouras cirúrgicas ou uma navalha nova. Nota: O deslocamento Cervical não é recomendado para esta etapa, devido ao tamanho e idade do animal. Esses métodos são coerentes com as orientações de AVMA 2013 sobre eutanásia e aprovaram pelo MGH IACUC.</li>
	<li>Colheita do cólon usando pinça limpa e tesoura para abrir o abdômen. Refletem os intestinos para 1 lado do abdômen do rato para expor o cólon. Remover o cólon inteiro pela primeira cruza-lo apenas distal (na direção do ânus) para o ceco. Então, enquanto segurando firmemente o cólon com fórceps, utilize tesouras para cortar através da uretra até ao recto. Corte o cólon como perto do ânus quanto possível. Colheita do baço após a remoção do cólon (ver etapas 4.1-4.2 abaixo). Nota: Enquanto o protocolo de photoconversion apenas alvos ~ 25% do cólon do recém-nascido (5 mm da cânula fibra óptica), todo o cólon é colhido para ajudar no isolamento da célula.</li>
	<li>Limpeza do cólon usando fórceps para empurrar o conteúdo fora do cólon e em uma toalha de papel seca. Homogeneizar o tecido usando lâminas de barbear, pique finamente o cólon em um colar na capa de um prato de cultura e depois transferir esta pasta para o filtro de célula na caixa de Petri.</li>
	<li>Adicionar uma barra de agitação magnética tempo limpo 8 mm para o filtro e coloque o prato em um prato de agitador magnético 9 posições. Definir a velocidade de barra de agitação magnética para 800 rpm e incube as celulas por 5 min à temperatura ambiente. Descartar o buffer e repita a lavagem com 10 mL de HBSS/CS (o HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo). Descarte o buffer no final da lavagem.</li>
	<li>Dissociar as células epiteliais, adicionando 10 mL de tampão de escaldadas tira epitelial (o HBSS; 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM de tampão de HEPES [pH 7,2-7,5] que foi feita no passo 3.1.2 e armazenado em banho maria a 37 ° C) para o filtro de célula e mexa a 800 rpm por 30 min em um 3 Incubadora de 7 ° C. No final da incubação, transferi o buffer enriquecido na fração epitelial para um tubo limpo 15 mL. Nota: O epitélio e o associado células (células epiteliais intestinais e os linfócitos epiteliais intestinais) são liberadas para o buffer, enquanto as células no intacto do propria do lamina permanecem no filtro célula durante esta etapa11.<ol>
<li>Centrifugue a fração epitelial intestinal (LAL) enriquecida a 700 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de FACS. Armazená-lo no gelo para uso na etapa 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave a fração propria do lamina dentro do filtro célula 2 x com HBSS/CS. Para fazer isso, adicionar 10 mL de solução HBSS/CS (HBSS; reserva de CS de 5% que foi feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.</li>
	<li>Lavar a amostra 2 x em meios de lavagem. Adicionar 10 mL de mídia de lavagem (HBSS; 1% CS; reserva de EDTA 1 mM que foi feita no passo 3.1.3 e armazenada à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 15 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.<ol>
<li>Depois de usar a mídia de lavagem, armazená-lo no gelo para o uso na etapa 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS. adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffer feitas na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.</li>
	<li>Incube o tecido em EDTA livre de tampão de lavagem. Adicionar 10 mL de tampão de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS; tampão HEPES de 15 mM que foi feito no passo 3.1.4 e armazenado à temperatura ambiente) para o filtro de célula e incubar a placa por 10 min à temperatura ambiente sem agitação. Descarte o buffer no final desta etapa.</li>
	<li>Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS e preparar a solução de enzima. Adicionar 10 mL de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) do buffer para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 10 minutos em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.<ol>
<li>Preparar a solução de enzima (EDTA livre lava tampão; 0,1 mg/mL DNase I; colagenase 167 mg/mL) durante o segundo período de lavagem: adicione 9 mg de DNase eu e 15 mg de liofilizado colagenase a 90 mL de EDTA livre wash buffer. Armazene a solução à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Digeri a fração propria do lamina contida no filtro célula obter propria do lamina linfócitos (LPLs). Adicionar 10 mL da solução de enzima (o EDTA livre o tampão de lavagem; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL de tampão de colagenase feitas na etapa 3.12.1 e armazenados à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 45 min em uma incubadora de 37 ° C. Nota: LPLs são liberados para a solução após a digestão enzimática.<ol>
<li>Recolher a solução de enzima que contém as células e filtrar através de um novo filtro de célula para um tubo cónico de 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione 20 mL de lavagem frio mídia (o HBSS; 1% CS; 1mM EDTA amortecedor feita na etapa 3.1.3 e armazenado no gelo na etapa 3.9.1) para as células filtradas para bloquear a atividade de colagenase na solução enzimática. Centrifugar o tubo a 700 x g, durante 6 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo LPLs em 1 mL de tampão de FACS.</li>
	<li>Combine o IEL (da etapa 3.7.1) e as frações LPL (da etapa 3.14) e manchá-las com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5). Nota: IEL e LPL frações podem ser manchadas separadamente se desejar informações de compartimento.</li>
</ol>4. isolamento de linfócitos do baço
<ol><li>Prepare o tubo de coleta adicionando 500 µ l de tampão de FACS em um tubo de microcentrifugadora. Armazená-lo no gelo.</li>
	<li>Após a remoção do cólon (passo 3.4), colher o baço inteiro e coloque-o no tubo de coleta. Armazene o tecido no gelo.</li>
	<li>Usando um homogeneizador de elétrica, homogeneizar o baço em um tubo de microcentrifugadora de aproximadamente 1 min. centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.</li>
	<li>Realizar a lise dos glóbulos vermelhos por resuspending a amostra em 500 µ l de tampão de lise de amónio-cloreto-potássio (ACK) para iniciar a morte celular por lise osmótica. Permitir que a amostra incubar 1-2 min à temperatura ambiente e então ele Resuspenda em 725 µ l de tampão de FACS.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 500 µ l de tampão de FACS e filtrar através de um filtro de célula de 40 µm para um novo tubo de microcentrifugadora. Transferir toda a amostra para um tubo de microcentrifugadora novo e manchá-la com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).</li>
</ol>5. identificação de Dendra-r+ citometria de fluxo utilizando células
<ol><li>Centrifugar as amostras IEL/LPL e baço a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas em 100 µ l de anticorpo que mancha a mistura. Prepare o anticorpo que mancha a mistura adicionando 1 µ l de conjugado fluorescente anti-CD45 anticorpo a 100 µ l de tampão de FACS por amostra. Nota: É importante dosear os anticorpos usados para a citometria de fluxo antes do experimento para determinar a concentração ideal onde ocorre a saturação de vinculação.</li>
	<li>Incube as amostras para 35 min no gelo (em um local escuro).</li>
	<li>Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACS e centrifugá-los a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 325 µ l de tampão de FACS. Analise as amostras em um citômetro de fluxo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system.">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li><li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii.">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li><li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells.">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li><li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut.">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A identificação e caracterização de células que interagem com e são influenciados pela microbiota do cólon são importantes e devem facilitar a compreensão de como a informação do microambiente da mucosa é retransmitida para o resto do corpo. Um método para estudar a migração celular relacionados ao intestino requer o isolamento de células associada a barriga, seguido por uma transferência adotiva em camundongos destinatários para determinar os padrões de tecido-homing e funcionar12</s...

O trato gastrointestinal dos mamíferos abriga centenas de espécies de bactérias que podem existirem em uma relação simbiótica com o host1. As células do sistema imunológico presentes no meio local impor uma coexistência pacífica com estes micróbios e estabelecer uma barreira de proteção contra invasões de patógeno. Assim, bi-direcional interações entre as células do sistema imunológico e a microbiota são fundamentais para estabelecer uma comunidade comensal que educa o sistema imunológico do hospedeiro e define o limiar de reatividade imune a patógenos. Mudanças no microbiana composição, ou disbiose, pode perturbam a homeostase imune e perturbam circuitos regulamentares que conter inflamações intestinais, levando a imune-mediada doenças como a Diabetes tipo 1 e IBD2,3 .
O período imediatamente após o nascimento é uma única do desenvolvimento durante o qual as comunidades microbianas intestinais começam a estabelecer, ao mesmo tempo, o sistema imunológico amadurece4. A microbiota pós-Natal não é estável, com mudanças na composição da Comunidade ocorrendo naturalmente e frequentemente5. As células imunitárias que interagem com a microbiota residem em duas distintas anatômicas locais no intestino - a propria do lamina e o epitélio intestinal6. Vários tipos de células do sistema imunológico estão presentes no intestino, incluindo linfócitos (tais como as células T, células B e células linfoides inatas), bem como de células mieloides (que incluem os monócitos, macrófagos e células dendríticas). Estas células, também conhecido como células hematopoiéticas, executam uma variedade de funções que preservam a barreira intestinal e manter a homeostase.
Além de suas funções reguladoras locais intestinal, células do sistema imunológico da mucosa também podem efectuar microbianas mensagens aos sites extra intestinais para regular a imunidade sistêmica7,8,9. Esta é uma área de crescente interesse de pesquisa e destaca a necessidade de métodos para identificar as células imunes que migram fora tecidos intestinais, a fim de sondar a sua função. O protocolo relatado aqui utiliza um modelo de mouse disponíveis comercialmente em que uma proteína fluorescente photoconvertible é explorada para células de rótulo. PhAMextirpado ratos ubiquitously expressam uma proteína verde fluorescente Dendra2 que é irreversivelmente ligam para fluorescência vermelha após a ativação por ultravioleta (UV) luz10. Usando uma cânula de fibra óptica para fornecer luz de nm 405 no cólon de ratos recém-nascidos, demonstramos que photoconverted de células hematopoiéticas, que se originou em ou transitar através do cólon pode ser encontrado no baço.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Laser&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetics patch cable</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optic cannula</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &amp;micro;m and an inner diameter of 480 &amp;micro;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 laser safety goggles&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Red light&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intestinal cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Micro magnetic stir bar</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single cell suspension&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homogenizer tips&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

Comunidades de bactérias entéricas são estabelecidas no início da vida e influenciam a função e o desenvolvimento de células imunes. A microbiota neonatal é suscetível a inúmeras influências externas, incluindo o uso de antibióticos e dieta, que afeta a susceptibilidade a doenças auto-imunes e inflamatórias. Doenças como a doença intestinal inflamatória (IBD) caracterizam-se por um afluxo maciço de células do sistema imunológico para os intestinos. No entanto, células imunes, condicionadas pela microbiota podem adicionalmente emigrar fora os intestinos para influenciar as respostas imunes locais extra intestinal. Assim, há uma necessidade de identificar e caracterizar as células que podem transportar mensagens microbianas do intestino para sites distais. Aqui, descrevemos um método para células de rótulo no cólon de ratos recém-nascidos na vivo que permite a sua identificação nos sites extra intestinais após a migração.

Um cabo de fibra óptica foi usado para lançar 405 luz nm para os dois-pontos de 2 - velho dias PhAMextirpado ratos. Em experimentos anteriores, determinou-se uma exposição de 30 s para dar uma photoconversion máxima de células do cólon com mínima citotoxicidade (Figura 1A). Portanto, sequencial 30 exposições de s de diferentes segmentos do cólon foram realizadas conforme descrito no protocolo. Após a exposição do lase...

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

O protocolo descrito aqui utiliza uma abordagem photolabeling em camundongos recém-nascidos para identificar especificamente as células do sistema imunológico que emigram do cólon para sites extra intestinais. Esta estratégia será útil para estudar interações do anfitrião-microbiome no início da vida.

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K visualizações.  Massachusetts General Hospital. O protocolo descrito aqui utiliza uma abordagem photolabeling em camundongos recém-nascidos para identificar especificamente as células do sistema imunológico que emigram do cólon para sites extra intestinais. Esta estratégia será útil para estudar interações do anfitrião-microbiome no início da vida.

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A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Biologia do Desenvolvimento

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologia

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Utilização de<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Imunologia e Infecção

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Pesquisa do câncer

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Medicina

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

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