Nitya Jain è stato sostenuto da un premio di transizione di carriera NIH/NIAID 1K22AI116661-01.

Tutte le procedure degli animali sono state effettuate con l'approvazione di e conforme ai istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital.
Attenzione: Questo protocollo prevede l'utilizzo di un laser di classe 3b (LG3). LG3 laser occhiali di sicurezza devono sempre essere utilizzati quando si opera questo laser. Opportune linee guida formazione e sicurezza devono essere seguite per evitare il rischio di lesioni.
1. progettazione e assemblaggio di Laser
<ol><li>Collegare il diodo luminoso (LED) (405 nm, 19,3 mW, mA 1400, accoppiati in fibra) al LED driver tramite il cavo del connettore M8 a 4 pin che viene collegato al LED. Serrare la vite per fissare il raccordo.</li>
	<li>Prima di collegare il cavo di patch optogenetica al LED, tenere il connettore apertura del LED fino alla luce affinché non ci siano ostruzioni visibili. Colpo sul foro per eliminare eventuali ostruzioni Se necessario e inserire il cavo di patch optogenetica nell'apertura.</li>
	<li>Collegare la cannula di fibra ottica per il cavo di patch optogenetica inserendo la cannula in entrambe le estremità del manicotto connettore. Collegare l'altra estremità del manicotto connettore per il cavo di patch.  Applicare una pressione sufficiente a garantire la connessione, ma fare attenzione a non piegare o rompere la fibra ottica nella cannula. Nota: La cannula di fragile fibra ottica è coperto con il cappuccio di protezione ogni volta che il laser non è in uso.</li>
	<li>Impostare il driver di LED per la modalità onda continua (CW) con la manopola di regolazione continua a 0 e il limite di corrente impostato su 1,2 A.</li>
</ol>2. fotoconversione delle cellule del colon
Nota: Topi maschi e femmine sono stati esposti alla luce di intracolonic 405 nm 1-2 giorno (i) dopo la loro nascita e sono stati sacrificati prima di 1 settimana di età.
<ol><li>Garantire un luogo buio con un accesso ad una presa elettrica. Inserire il driver del LED la presa. Nota: Questa procedura viene eseguita nella minima luce bianca come una lunga esposizione dei topi alla luce dell'ambiente può causare un indesiderato fotoconversione delle cellule. Luce rossa è utilizzato come alternativa. Attenzione: Il passo successivo prevede l'utilizzo di un animale anestetico. La somministrazione di anestetico si svolge in una cappa di classe II o utilizzando un altro sistema di lavaggio appropriato. L'inalazione dell'anestetico può causare capogiri, sonnolenza o anche uno stato di incoscienza.</li>
	<li>Anestetizzare il mouse dall'esposizione all'isoflurano 4-5% a 100% O2 in una scatola di induzione. Verificare la corretta profondità di anestesia pinzando saldamente una zampa posteriore (nessuna risposta). Mantenere l'anestesia tramite un cono di naso a circa il 2% isoflurane. Evitare l'esposizione del gestore a isoflurano dall'uso di un'appropriata cappa o anestetico dispositivo scavenging.</li>
	<li>Posizionare il mouse anestetizzato per l'esposizione di intracolonic utilizzando 1 mano a collottola sul retro del mouse delicatamente con il dito indice e il pollice. Capovolgi il mouse per esporre l'addome. Se il mouse comincia a perdere il suo colore rosa o se il tasso di respirazione inizia a rallentare, allentare la presa. Fissare la coda del mouse tra l'anulare e il mignolo.</li>
	<li>Con l'altra mano, rimuovere il cappuccio protettivo dalla cannula. Pur mantenendo l'asse lungo della cannula parallela alla linea mediana del mouse, inserire delicatamente la cannula di fibra ottica attraverso l'ano nel colon affinché tutti i 5mm della fibra ottica sono all'interno del mouse. Nota: Questa procedura viene eseguita lentamente e con attenzione a non forare la parete colica. Minuto dimenando e torsione della cannula aiuta l'avanzamento nel colon.</li>
	<li>Indossare gli occhiali di sicurezza e aumentare il laser corrente al valore massimo (tutto in senso orario). Confermare la presenza di luce UV guardando l'addome traslucido del mouse. Nota: Gli occhiali di protezione laser LG3 diminuiscono drasticamente la visibilità. Sono un collega (dispositivi di protezione da portare) aiutare a indossare gli occhiali e accendere il laser.</li>
	<li>Esporre il colon per la luce laser per un totale di 2 min. ritirare la cannula circa 1 mm ogni 30 s per massimizzare l'area luminal esposto alla luce. Alla fine di 2 min, spegnere il laser.</li>
	<li>Rimuovere lentamente la cannula dal mouse. Dopo il recupero dall'anestesia in una gabbia calda vuota, tornare il mouse dalla gabbia.</li>
</ol>3. isolamento dei linfociti intestinali
<ol><li>Preparare 1 L di tampone di siero (HBSS/CS) soluzione salina bilanciata/vitello di Hank, 200 mL di tampone epiteliale striscia, 500 mL di lavaggio mezzi e 200 mL dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-lavare i media liberi. Nota: I volumi di reagente sono calcolati per una dimensione del campione di 9.<ol>
<li>Rendere il buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) aggiungendo 50 mL di CS a 950 mL di HBSS. Memorizzata sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare il tampone di striscia epiteliali [HBSS; 5% CS; 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA acido di 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) piperazina-1-etansolfonico (HEPES) (pH 7.2-7.5)] aggiungendo 10 mL di CS, 200 µ l di 1 M DTT, 2 mL di EDTA 0.5 M e 3 mL di tampone HEPES 1m a 185 mL di HBSS. Posto il buffer di striscia epiteliale in bagnomaria a 37 ° C.</li>
		<li>Fai il media di lavaggio (HBSS; 1% CS; 1 mM EDTA) aggiungendo 5 mL di CS e 1 mL di EDTA 0,5 M a 494 mL di HBSS. Conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare il supporto di lavaggio senza EDTA (HBSS; 1% CS; 15 mM HEPES) con l'aggiunta di 2 mL di CS e 3 mL di 1 M HEPES a 195 mL di HBSS. Conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rendere un FACS buffer [1x tamponato fosfato salino (PBS) (pH = 7.2); 2% CS] con l'aggiunta di 10 mL di CS a 490 mL di PBS. Memorizzata sul ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il piatto di raccolta del tessuto inserendo un colino di cella µm 70 all'interno di una piastra di coltura 60 x 10 mm. Aggiungere 10 mL di tampone HBSS/CS (HBSS; 5% buffer di CS effettuata nel passaggio 3.1.1 e conservati nel ghiaccio) al piatto e posizionarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Eutanasia il mouse tramite un'overdose di inalazione isoflurane utilizzando lo scavenging appropriato di anestetico (un'esposizione di circa 3 min a > 4% isoflurane nell'aria della stanza o in 100% O2). Dopo apparente cessazione della respirazione e reflex movimento, verificare l'assenza di dolore profondo pinzando saldamente una zampa posteriore (usando il forcipe è consigliato). Garantire l'eutanasia tramite una decapitazione utilizzando un paio di forbici chirurgiche o un rasoio nuovo. Nota: Dislocazione cervicale non è raccomandata per questo passo a causa delle dimensioni e l'età dell'animale. Questi metodi sono coerenti con le linee guida AVMA 2013 sull'eutanasia e approvato dal MGH IACUC.</li>
	<li>Raccogliere il colon usando pulite pinze e le forbici per aprire l'addome. Riflettere gli intestini al 1 lato dell'addome del mouse per esporre i due punti. Rimuovere tutto il colon transecting primo esso appena distale (verso l'ano) al cieco. Quindi, mentre afferrando saldamente i due punti con il forcipe, usare le forbici per tagliare attraverso l'uretra, il retto. Tagliare i due punti come vicino all'ano come possibile. Raccogliere la milza dopo la rimozione del colon (Vedi punti 4.1-4.2 qui sotto). Nota: Mentre il protocollo di fotoconversione destinato solo a ~ 25% dei due punti del neonato (5 mm della cannula fibra ottica), tutto il colon è raccolto per facilitare l'isolamento delle cellule.</li>
	<li>Pulizia del colon usando il forcipe per spingere il contenuto fuori del colon e su un tovagliolo di carta a secco. Omogeneizzare il tessuto utilizzando lamette per tritare finemente i due punti in una pasta sulla copertina di una piastra di coltura e poi trasferire questa pasta al filtro cella in di Petri.</li>
	<li>Aggiungere un ancoretta magnetica lunga 8mm pulito il filtro e collocare il piatto su un piatto di agitatore magnetico 9-posizione. Impostare la velocità di barra magnetica a 800 giri/min e incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il buffer e ripetere il lavaggio utilizzando 10 mL di HBSS/CS (L'HBSS; 5% buffer di CS effettuata nel passaggio 3.1.1 e conservati nel ghiaccio). Scartare il buffer alla fine del lavaggio.</li>
	<li>Dissociare le cellule epiteliali con l'aggiunta di 10 mL di tampone preriscaldati striscia epiteliale (L'HBSS; 5% CS; 5mm EDTA; 1 millimetro DTT, tampone HEPES [pH 7.2-7.5] di 15mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.2 e memorizzati in bagnomaria a 37 ° C) al filtro cella e mescolare a 800 rpm per 30 min in un 3 Incubatrice di 7 ° C. Al termine dell'incubazione, l'arricchito nella frazione epiteliale ad un tubo pulito da 15 mL di buffer di trasferimento. Nota: L'epitelio e associato le cellule (cellule epiteliali intestinali e i linfociti epiteliali intestinali) vengono rilasciate nel buffer, mentre le cellule nel intatto della lamina propria rimangono sul filtro cella durante questo passaggio11.<ol>
<li>Centrifugare la frazione epiteliale intestinale arricchita (IELs) a 700 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di FACS. Memorizzarlo sul ghiaccio per uso nel punto 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare la frazione della lamina propria all'interno del filtro cella 2 x con HBSS/CS. A tale scopo, aggiungere 10 mL di soluzione HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% che è stato fatto nel passaggio 3.1.1 che è stato memorizzato sul ghiaccio) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 5 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Lavare il campione 2 x lavaggio media. Aggiungere 10 mL di lavaggio media (HBSS; 1% CS; soluzione tampone dell'EDTA 1 mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.3 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 15 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.<ol>
<li>Dopo aver utilizzato i media di lavaggio, memorizzarlo sul ghiaccio per l'utilizzo nel passaggio 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare il campione 2 x con HBSS/CS. aggiungere 10 mL di tampone HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% fatta al punto 3.1.1 è stato archiviato in ghiaccio) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 5 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Incubare il tessuto nel tampone di lavaggio senza EDTA. Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio senza EDTA (HBSS; 1% CS; tampone HEPES 15 mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.4 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente senza mescolare. Scartare il buffer alla fine di questo passaggio.</li>
	<li>Lavare il campione 2 x con HBSS/CS e preparare la soluzione di enzima. Aggiungere 10 mL di HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% effettuata nel passaggio 3.1.1 che è stato memorizzato sul ghiaccio) nel buffer al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 10 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.<ol>
<li>Preparare la soluzione di enzima (privo di EDTA lavare buffer; 0,1 mg/mL dnasi I; collagenosi 167 mg/mL) durante il secondo periodo di lavaggio: aggiungere 9 mg di dnasi I e 15 mg di liofilizzato collagenosi a 90 mL di EDTA-free il tampone di lavaggio. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Digerire la frazione propria di lamina contenuta nel colino cella per ottenere i linfociti della lamina propria (LPLs). Aggiungere 10 mL della soluzione enzimatica (EDTA-libero il tampone di lavaggio; 0,1 mg/mL dnasi I; 167 mg/mL di tampone di collagenasi effettuata nel passaggio 3.12.1 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 45 min in un incubatore a 37 ° C. Nota: LPLs vengono rilasciati nella soluzione dopo la digestione enzimatica.<ol>
<li>Raccogliere la soluzione enzima contenente le celle e filtrarlo attraverso un colino di cella nuova in una provetta conica da 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 20 mL di media di lavaggio a freddo (L'HBSS; 1% CS; 1mM EDTA tampone fatta al punto 3.1.3 e memorizzati sul ghiaccio nel passaggio 3.9.1) alle cellule filtrate per bloccare l'attività della collagenosi nella soluzione degli enzimi. Centrifugare la provetta a 700 x g per 6 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet contenente LPLs in 1 mL di tampone di FACS.</li>
	<li>Combinare la IEL (dal punto 3.7.1) e le frazioni LPL (dal punto 3.14) e li macchia con anticorpi coniugati fluorescenti per l'analisi cytometric di flusso (vedi passo 5). Nota: IEL e LPL frazioni possono essere macchiate separatamente se non si desidera informazioni di vano.</li>
</ol>4. isolamento dei linfociti dalla milza
<ol><li>Preparare il tubo di raccolta aggiungendo 500 µ l di tampone di FACS in un tubo del microcentrifuge. Memorizzarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Dopo aver rimosso i due punti (punto 3.4), raccogliere la milza intera e inserirlo nel tubo di raccolta. Conservare il tessuto sul ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando un omogeneizzatore del tessuto elettrico, omogeneizzare milza in una microcentrifuga per circa 1 min. Centrifugare il campione a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante.</li>
	<li>Per eseguire la lisi dei globuli rossi, risospendere il campione in 500 µ l di tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) per avviare la morte cellulare da lisi osmotica. Lasciare il campione Incubare per 1-2 minuti a temperatura ambiente e poi e risospendere in 725 µ l di tampone di FACS.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante. Risospendere il pellet in 500 µ l di tampone di FACS e filtrarlo attraverso un colino di cella di 40 µm in un nuovo tubo del microcentrifuge. L'intero campione di trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge e macchia con anticorpi coniugati fluorescenti per l'analisi cytometric di flusso (vedi passo 5).</li>
</ol>5. identificazione di Dendra-r+ cellule tramite flusso Cytometry
<ol><li>Centrifugare i campioni IEL/LPL e milza a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 100 µ l di anticorpo che macchia mix. Preparare l'anticorpo che macchia mix aggiungendo 1 µ l di anticorpo fluorescente coniugato anti-CD45 a 100 µ l di tampone di FACS per campione. Nota: È importante a titolare gli anticorpi utilizzati per la citometria di flusso prima dell'esperimento per determinare la concentrazione ottimale dove si verifica la saturazione di associazione.</li>
	<li>Incubare i campioni per 35 min su ghiaccio (in un luogo buio).</li>
	<li>Risospendere i campioni a 300 µ l di tampone di FACS e li Centrifugare a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere i campioni in 325 µ l di tampone di FACS. Analizzare i campioni su un citometro a flusso.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system.">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li><li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut.">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'identificazione e la caratterizzazione delle cellule che interagiscono e sono influenzati dal microbiota del colon sono importanti e dovrebbero facilitare la comprensione di come le informazioni dal microambiente mucoso viene inoltrati al resto del corpo. Un metodo per studiare la migrazione delle cellule dell'intestino richiede l'isolamento di cellule associato all'intestino, seguita da un trasferimento adottivo in topi destinatari per determinare i modelli di tessuto-homing e funzione12,<...

Il tratto gastrointestinale dei mammiferi ospita centinaia di specie di batteri presenti in un rapporto simbiotico con l'host1. Le cellule immunitarie presenti nell'ambiente locale applicare una coesistenza pacifica con questi microbi e stabilire una barriera protettiva contro le invasioni di agente patogeno. Così, bi-direzionale interazioni tra le cellule immunitarie e il microbiota sono fondamentali per stabilire una comunità commensale che educa il sistema immunitario dell'ospite e imposta la soglia per la reattività immune agli agenti patogeni. Cambiamenti nel microbiche composizione, o disbiosi, può disturbano l'omeostasi immunitaria e perturbano circuiti regolatori che trattengono infiammazioni intestinali che portano a malattie immuno-mediate come diabete di tipo 1 e IBD2,3 .
Il periodo immediatamente dopo la nascita è un'unica finestra inerente allo sviluppo durante il quale le comunità microbiche intestinali cominciano a stabilire allo stesso tempo il sistema immunitario matura4. Il microbiota postnatale non è stabile, con variazioni nella composizione della comunità che si verificano naturalmente e frequentemente5. Le cellule immunitarie che interagiscono con il microbiota risiedono in due distinte posizioni anatomiche nell'intestino - della propria di lamina e l' epitelio intestinale6. Numerosi tipi di cellule immunitarie sono presenti nell'intestino, compreso i linfociti (ad esempio cellule T, cellule B e cellule linfoidi innate) così come le cellule mieloidi (che includono macrofagi, monociti e cellule dendritiche). Queste cellule, anche conosciuto come cellule ematopoietiche, eseguono una moltitudine di funzioni che preservare la barriera intestinale e mantenere l'omeostasi.
Oltre alle loro funzioni di regolamentazione presso siti intestinali, le cellule immuni della mucosa possono anche portare messaggi microbici ai siti extra-intestinali per regolare l'immunità sistemica7,8,9. Questa è un'area di crescente interesse per la ricerca e sottolinea la necessità di metodi per identificare le cellule immunitarie che migrano dai tessuti intestinali al fine di sondare la loro funzione. Il protocollo segnalato qui utilizza un modello di topo commercialmente disponibili in cui viene sfruttata una proteina fluorescente fotoconvertibile alle cellule di etichetta. PhAMasportato topi ubiquistmente esprimono una proteina fluorescente verde di Dendra2 che è irreversibilmente passata a fluorescenza rossa al momento dell'attivazione di raggi ultravioletti (UV) luce10. Utilizzando una cannula di fibra ottica per consegnare 405 nm luce nel colon dei topi neonati, dimostriamo che le cellule ematopoietiche photoconverted, che hanno provenuto o transitato attraverso il colon possono essere trovate nella milza.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Laser</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Light Emitting Diode (LED)</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M405FP1</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">LED driver</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:247px;">Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Optogenetics patch cable</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M87L01</td>
			<td style="width:247px;">1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&#38;pn=M87L01#11454</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Fiber optic cannula</td>
			<td style="width:201px;">Doric lenses&#160;</td>
			<td style="width:167px;">MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td>
			<td style="width:247px;">5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &#181;m and an inner diameter of 480 &#181;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Power supply</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">KPS101</td>
			<td style="width:247px;">Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">LG3 laser safety goggles&#160;</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LG3</td>
			<td style="width:247px;">Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&#38;pn=LG3#2523</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Red light&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74327-10</td>
			<td style="width:247px;">15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Intestinal cell isolation</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:201px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:167px;">07-893-1389</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&#160; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">1X HBSS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">14025076</td>
			<td style="width:247px;">Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&#38;searchTerm=14025076&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=14025076</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Calf Serum</td>
			<td style="width:201px;">Hyclone AZM</td>
			<td style="width:167px;">197696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">EDTA</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">15575020</td>
			<td style="width:247px;">0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">DTT</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10197777001</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">15630080</td>
			<td style="width:247px;">1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Petri dish</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">353004</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&#38;searchTerm=08772F&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=08772F</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">70 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Micro magnetic stir bar</td>
			<td style="width:201px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:167px;">1451364</td>
			<td style="width:247px;">Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:201px;">Corning Laboratory Stirrers</td>
			<td style="width:167px;">440826</td>
			<td style="width:247px;">https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&#38;persist=true&#38;ip=no&#38;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Collagenase</td>
			<td style="width:201px;">Roche</td>
			<td style="width:167px;">5401020001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&#38;region=US&#38;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">DNase I</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10104159001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">1X PBS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">20012-027</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">Pipet aid</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">14387165</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357530</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">25 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357515</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339651</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339653</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Single cell suspension</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:201px;">Seal-Rite</td>
			<td style="width:167px;">1615-5500</td>
			<td style="width:247px;">Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Tissue homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td>K7495400000</td>
			<td style="width:247px;">Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Homogenizer tips&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td style="width:167px;">7495210590</td>
			<td style="width:247px;">Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">A10492-01</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">40 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">08-771-1</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Antibodies</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">BV786 anti-mouse CD45&#160;</td>
			<td style="width:201px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">564225</td>
			<td style="width:247px;">Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Live/Dead</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Other</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:247px;">Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

Comunità batteriche enteriche sono stabilite all'inizio della vita e influenzano la funzione e lo sviluppo delle cellule immuni. Il microbiota neonatale è suscettibile di numerose influenze esterne, tra cui l'uso di antibiotici e dieta, che urta la suscettibilità alle malattie autoimmuni ed infiammatorie. Disturbi come la malattia di viscere infiammatoria (IBD) sono caratterizzati da un massiccio afflusso di cellule immuni agli intestini. Tuttavia, le cellule immunitarie condizionate dal microbiota possono inoltre emigrare fuori gli intestini per influenzare le risposte immunitarie a siti extra-intestinali. Così, c'è una necessità di identificare e caratterizzare le cellule che possono trasportare messaggi microbici dall'intestino ai luoghi distali. Qui, descriviamo un metodo alle cellule di etichetta nel colon dei topi neonati in vivo che consenta la loro identificazione presso siti extra-intestinali dopo la migrazione.

Un cavo in fibra ottica è stato utilizzato per trasportare 405 nm luce in due punti dei topi diasportato 2 - giorno-vecchi PhAM. In precedenti esperimenti, un 30 s esposizione era deciso a dare una massima fotoconversione delle cellule del colon con minima citotossicità (Figura 1A). Di conseguenza, sequenziale 30 esposizioni di s dei diversi segmenti del colon sono state effettuate come descritto nel protocollo. In seguito l'espo...

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Il protocollo descritto qui utilizza un approccio di photolabeling in topi neonati per identificare in modo specifico le cellule immuni che emigrano dal colon in siti extra-intestinali. Questa strategia sarà utile per studiare le interazioni ospite-microbiome nella vita in anticipo.

In Vivo Photolabeling delle cellule del colon per valutare il potenziale migratorio delle cellule ematopoietiche in topi neonatali

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

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Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K Views.  Massachusetts General Hospital. Il protocollo descritto qui utilizza un approccio di photolabeling in topi neonati per identificare in modo specifico le cellule immuni che emigrano dal colon in siti extra-intestinali. Questa strategia sarà utile per studiare le interazioni ospite-microbiome nella vita in anticipo.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

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Medicina

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

Trapianto mammaria di cellule stromali e cellule di carcinoma in topi C57BL/6J

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F MRI per il tracciamento cellulare

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusi carotide di farmacocinetica e di farmacodinamica Analisi dei taxani nei topi

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria intrauterina misurare mouse contrattile Pressione<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...