Nitya Jain wurde durch ein NIH/NIAID Career Transition Award-1K22AI116661-01 unterstützt.

Alle tierische Verfahren wurden mit Zustimmung und unter Einhaltung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital durchgeführt.
Achtung: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von einem Laser der Klasse 3 b (LG3). LG3 Laserschutzbrillen müssen immer verwendet werden, wenn diese Laser in Betrieb. Entsprechende Schulung und Sicherheit Richtlinien befolgt werden, um das Risiko von Verletzungen zu vermeiden.
1. Aufbau und Montage von Laser
<ol><li>Schließen Sie die Leuchtdiode (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fasergekoppelte) der LED-Treiber über die 4-polige M8 Stecker Kabel, das kommt beigefügt, die LED. Sorgfältig die Schraube um die Verbindung zu befestigen.</li>
	<li>Vor dem Anbringen der optogenetik Patchkabel an die LED, halten Sie den Connector Öffnung der LED für das Licht, um sicherzustellen, dass keine sichtbare Hindernisse sind. Schlag auf das Loch, alle Hindernisse zu beseitigen, falls erforderlich und die optogenetik Patch-Kabel in die Öffnung einführen.</li>
	<li>Schließen Sie Fiber optic Kanüle durch einführen der Kanüle in beiden Enden der Steckverbinder Hülse an die optogenetik Patch-Kabel an. Legen Sie das andere Ende des Ärmels Connector auf Patch-Kabel.  Genügend Druck zu sichern die Verbindung aber nicht verbiegen oder brechen die optische Faser in die Kanüle vorsichtig sein. Hinweis: Die fragile Fiber optic Kanüle wird mit der Schutzkappe behandelt, wenn der Laser nicht benutzt wird.</li>
	<li>Stellen Sie die LED-Treiber in den kontinuierliche Welle (CW) Modus mit den kontinuierlichen Einstellknopf auf 0 und die Strombegrenzung auf 1,2 A. festgelegt</li>
</ol>(2) Ladungszustand der Zellen im Darm
Hinweis: Männliche und weibliche Mäuse wurden Intracolonic 405 nm Licht noch 1-2 Tage nach ihrer Geburt ausgesetzt und wurden geopfert, vor 1 Woche alt.
<ol><li>Einem dunklen Ort mit einem Zugang zu einer Steckdose zu sichern. Schließen Sie das LED-Netzteil an die Steckdose. Hinweis: Dieses Verfahren erfolgt in dem minimalen weißen Licht wie eine längere Belichtung der Mäuse an das Umgebungslicht eine unerwünschte Ladungszustand der Zellen führen kann. Rotes Licht wird als Alternative verwendet. Achtung: Der folgende Schritt bezieht den Gebrauch eines Tieres Narkose. Die Verwaltung des Betäubungsmittels erfolgt in Klasse II Kapuze oder mithilfe einer anderen geeigneten Aufräumvorgang Systems. Die Inhalation des Betäubungsmittels kann Schwindel, Benommenheit oder sogar Bewusstlosigkeit führen.</li>
	<li>Die Maus durch die Einwirkung von 4-5 % Isofluran in 100 % O2 in einer Induktion-Box zu betäuben. Überprüfen Sie richtige Tiefe der Narkose durch fest Kneifen eine Hinterpfote (keine Antwort). Pflegen Sie Anästhesie über eine bugnase bei ca. 2 % Isofluran. Verhindern Sie Handler Exposition gegenüber Isofluran durch Verwendung einer geeigneten Haube oder Narkose Aufräumvorgang Gerät.</li>
	<li>Position der narkotisierten Maus für die Intracolonic Belichtung mithilfe von 1 hand Scruff die Rückseite der Maus sanft mit dem Zeigefinger und dem Daumen. Schalten Sie die Maus über den Bauch aussetzen. Lösen Sie den Griff, wenn die Maus fängt an, seine rosa Farbe verlieren oder ihre Atemfrequenz beginnt sich zu verlangsamen. Sichern Sie das Ende der Maus zwischen dem Ring und kleinen Finger.</li>
	<li>Entfernen Sie mit der anderen Hand die Schutzkappe von der Kanüle. Unter Beibehaltung der Längsachse parallel zur Mittellinie der Maus, der Kanüle sanft legen Sie Fiber optic Kanüle durch den Anus in den Darm so, dass alle 5 mm der Lichtleitfaser sind im Inneren der Maus. Hinweis: Dieser Vorgang erfolgt langsam und mit Sorgfalt nicht auf die Kolon Wand zu perforieren. Minute wackeln und Verdrehen der Kanüle hilft bei die Weiterentwicklung in den Darm.</li>
	<li>Don die Schutzbrille und erhöhen Sie den Laser auf den maximalen Wert (ganz im Uhrzeigersinn). Bestätigen Sie die Anwesenheit von UV-Licht durch das Betrachten des transluzenten Bauches der Maus. Hinweis: Die LG3 Laserschutzbrillen verringern drastisch Sichtbarkeit. Haben ein Kollege (tragen Schutzausrüstung) helfen bei der Brille anziehen und Einschalten des Lasers.</li>
	<li>Setzen Sie dem Doppelpunkt, das Laserlicht für insgesamt 2 min. zurückziehen der Kanüle ca. 1 mm alle 30 s, der luminalen Umgebung ausgesetzt, das Licht zu maximieren. Am Ende von 2 min schalten Sie den Laser aus.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kanüle langsam von der Maus. Nach der Genesung von Anästhesie in einem leeren Käfig warm, die Maus zu Hause Käfig zurück</li>
</ol>3. Isolation von Darm-Lymphozyten
<ol><li>Bereiten Sie 1 L die Hank ausgewogen Salz Lösung/Kalb Serum (HBSS/CS) Puffer, 200 mL von epithelialen Streifen Puffer, 500 mL waschen Medien und 200 mL Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-freie Medien zu waschen. Hinweis: Die Reagenz Mengen sind für eine Stichprobengröße von 9 berechnet.<ol>
<li>Machen Sie den HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS) durch Zugabe von 50 mL CS bis 950 mL HBSS. Bewahren Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Vorbereiten des epithelialen Streifen Puffers [HBSS; 5 % CS; 5 mM EDTA; 1 mM Dithiothreitol (DTT), 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES) (pH 7,2-7,5)] durch Zugabe von 10 mL CS 200 µL des DVB-t, 2 mL 0,5 M EDTA und 3 mL 1 M HEPES-Puffer 1 M bis 185 mL von HBSS. Ort der epithelialen Streifen-Puffer in einem 37 ° C-Wasserbad.</li>
		<li>Machen Sie waschen-Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA) durch Zugabe von 5 mL CS und 1 mL 0,5 M EDTA auf 494 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie die EDTA-freie Wäsche Medien (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES vor) durch Zugabe von 2 mL CS und 3 mL 1 M HEPES auf 195 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Machen einen FACS-Puffer [1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,2); 2 % CS] durch Zugabe von 10 mL CS bis 490 mL PBS. Bewahren Sie es auf dem Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie das Gewebe Sammlung Gericht, indem man ein 70 µm Zelle Sieb in der Kulturschale 60 x 10 mm. Das Gericht 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 hergestellt und auf Eis gelagert) hinzu, und legen Sie es auf dem Eis.</li>
	<li>Der Maus über eine Überdosierung von inhalativen Isofluran mit entsprechenden Aufräumvorgang von Narkose einschläfern (ein ca. 3 min Exposition gegenüber > 4 % Isofluran in der Raumluft oder 100 % O2). Nach dem scheinbaren Einstellung der Atmung und reflex-Bewegung, die Abwesenheit von tiefen Schmerz durch eine Hinterpfote fest kneifen zu überprüfen (mit Pinzette wird empfohlen). Stellen Sie sicher der Euthanasie über eine Enthauptung mit der Chirurgische Schere oder ein neues Rasiermesser. Hinweis: Zervikale Dislokation empfiehlt sich nicht für diesen Schritt aufgrund der Größe und Alter des Tieres. Diese Methoden sind im Einklang mit den 2013 AVMA Richtlinien über Sterbehilfe und von der MGH IACUC genehmigt.</li>
	<li>Ernten Sie den Doppelpunkt mit saubere Zange und Schere um den Bauch zu öffnen. Spiegeln Sie den Darm zu 1 Seite der Maus Abdomen Dickdarm aussetzen. Entfernen Sie den gesamten Dickdarm durch erste transecting es nur distal (in Richtung des Afters), der Blinddarm. Verwenden Sie dann während fest greifen den Darm mit der Pinzette, Schere, Schneiden durch die Harnröhre, den Enddarm. Schneiden Sie den Doppelpunkt als in der Nähe des Afters wie möglich. Ernte die Milz nach dem Entfernen des Dickdarms (siehe Schritte 4.1-4.2 unten). Hinweis: Während der Ladungszustand Protokoll nur ~ 25 % der Neugeborenen Colon (5 mm der Fiber optic Kanüle) richtet, ist der gesamte Dickdarm geerntet, um die Zelle isoliert zu unterstützen.</li>
	<li>Reinigen Sie den Doppelpunkt mit Zange um den Inhalt aus dem Dickdarm und auf einem trockenen Papiertuch zu schieben. Das Gewebe mit Rasierklingen fein hacken des Dickdarms zu einer Paste auf dem Cover von einer Kulturschale und übertragen diese Paste in die Zelle Sieb in der Petrischale zu homogenisieren.</li>
	<li>Fügen Sie eine saubere 8 mm lange magnetische Stir Bar in das Sieb und legen Sie die Schüssel auf einen 9-Position Magnetrührer Teller. Die magnetische Stir Bar Geschwindigkeit auf 800 u/min und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Den Puffer zu verwerfen und mit 10 mL HBSS/CS (die HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 vorgenommen und gespeichert auf dem Eis) zu wiederholen. Verwerfen Sie den Puffer am Ende des SPÜLPROGRAMMS.</li>
	<li>Die Epithelzellen durch Zugabe von 10 mL vorgewärmte epithelialen Streifen Puffer (die HBSS 5 % CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM HEPES [pH 7,2-7,5] Puffer, der war im Schritt 3.1.2 hergestellt und gelagert in einem Wasserbad von 37 ° C) in die Zelle Sieb zu distanzieren und bei 800 u/min für 30 min in einem 3 rühren 7 ° C Inkubator. Am Ende der Inkubation übertragen des Puffers bereichert in der epithelialen Fraktion um eine saubere 15 mL-Tube. Hinweis: Das Epithel und die zugehörigen Zellen (intestinale Epithelzellen und der intestinalen epithelialen Lymphozyten) sind in den Puffer veröffentlicht, während die Zellen in die intakte Lamina Propria auf die Zelle Sieb während dieser Schritt11bleiben.<ol>
<li>Zentrifugieren Sie den angereicherten intestinalen epithelialen Bruch (Lal) 700 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der FACS-Puffer. Bewahren Sie es auf dem Eis für Schritt 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschen den Lamina Propria Bruch innerhalb der Zelle Sieb 2 X mit HBSS/CS. Dazu die Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Lösung (HBSS; 5 % CS Puffer, die im Schritt 3.1.1 gemacht wurde, die auf dem Eis gespeichert wurden) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe 2 X Waschen Medien. Die Zelle Sieb 10 mL waschen Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA Puffer, die im Schritt 3.1.3 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 15 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.<ol>
<li>Bewahren Sie nach der Verwendung waschen Medien es auf dem Eis für den Einsatz im Schritt 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer in 3.1.1 Schritt gemacht, der auf dem Eis gespeichert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gewebe in EDTA-freie Waschpuffer. Fügen Sie 10 mL EDTA-freie Waschpuffer (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES-Puffer, der in Schritt 3.1.4 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) in die Zelle Sieb und inkubieren Sie die Platte für 10 min bei Raumtemperatur ohne sich zu rühren. Verwerfen Sie den Puffer am Ende dieses Schrittes.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS und bereiten Sie die Enzymlösung. Fügen Sie 10 mL HBSS/CS (HBSS; 5 % CS Puffer gemacht synchron 3.1.1 auf Eis gespeichert wurde) in die Zelle Sieb Puffern und rühren Sie es mit 800 u/min für 10 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.<ol>
<li>Vorbereiten der Enzymlösung (EDTA-frei waschen Puffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase) während der zweiten Periode waschen: 9 mg hinzufügen der DNase I und 15 mg gefriergetrockneten Kollagenase, 90 mL EDTA-freie Puffer waschen. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Lamina Propria Bruchteil enthalten in der Zelle Sieb Lamina Propria Lymphozyten (Vormerkung) zu verdauen. Fügen Sie 10 mL der Enzymlösung (EDTA-freie Waschpuffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase Puffer in Schritt 3.12.1 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert) in die Zelle Sieb und rühren Sie es mit 800 u/min für 45 min in einem Inkubator 37 ° C. Hinweis: Vormerkung gelangen in die Lösung nach der enzymatischen Verdauung.<ol>
<li>Sammeln Sie das Enzym-Lösung enthält die Zellen zu und Filtern sie durch eine neue Zelle Sieb in ein 50 mL konische Röhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Die gefilterten Zellen zu blockieren, die Kollagenase-Aktivität in der Enzymlösung fügen Sie 20 mL kaltwäsche Medien (die HBSS; 1 % CS; 1mM EDTA Puffer im Schritt 3.1.3 gemacht und gespeichert auf dem Eis im Schritt 3.9.1 hinzu). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 700 X g für 6 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellets, die Vormerkung in 1 mL der FACS-Puffer enthalten.</li>
	<li>Kombinieren Sie IEL (aus Schritt 3.7.1) und die LPL (aus Schritt 3.14) Brüche und Färben sie mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5). Hinweis: IEL und LPL Fraktionen können separat gefärbt werden, wenn Fach Informationen gewünscht wird.</li>
</ol>4. Isolierung von Lymphozyten aus der Milz
<ol><li>Bereiten Sie das sammelröhrchen durch Zugabe von 500 µL FACS Puffer zu einem Microcentrifuge Schlauch. Bewahren Sie es auf dem Eis.</li>
	<li>Nach dem Entfernen des Dickdarms (Schritt 3.4), Ernten Sie die ganze Milz und legen Sie sie in das sammelröhrchen. Speichern Sie das Gewebe auf dem Eis.</li>
	<li>Mit Hilfe einer elektrischen Gewebe-Homogenisator, Homogenisieren der Milz in einem Microcentrifuge Schlauch für ca. 1 min. Zentrifuge der Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.</li>
	<li>Führen Sie die Lyse der roten Blutkörperchen durch resuspending der Probenmaterials in 500 µL Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer, Zelltod durch osmotische Lyse zu initiieren. Lassen Sie die Probe 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren und es dann in 725 µL FACS Puffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand. Aufschwemmen Sie das Pellet in 500 µL Puffer FACS und Filtern sie durch ein Sieb 40 µm Zelle zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch. Die gesamte Probe zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen und Färben Sie es mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5).</li>
</ol>5. Identifizierung von Dendra-R+ Zellen mittels Flow Cytometry
<ol><li>Zentrifugieren Sie IEL/LPL und Milz Proben bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie die Pellets in 100 µL Antikörper Färbung Mischung. Vorbereiten des Antikörpers Färbung Mischung durch Zugabe von 1 µL eindringmittel konjugierten Anti-CD45 Antikörper zu 100 µL FACS Puffer pro Probe. Hinweis: Es ist wichtig, die Antikörper für die Durchflusszytometrie vor dem Experiment zur Bestimmung der optimalen Konzentration wo tritt verbindlich Sättigung verwendet titrieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben auf Eis (an einem dunklen Ort) 35 min.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie die Proben in 300 µL Puffer FACS und Zentrifugieren sie 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Proben in 325 µL FACS-Puffer. Analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Identifizierung und Charakterisierung von Zellen, die Interaktion mit und sind beeinflusst durch die Mikrobiota im Dickdarm sind wichtig und sollten erleichtern Überblick darüber, wie Informationen aus der Schleimhaut Mikroumgebung für den Rest des Körpers weitergeleitet wird. Eine Methode zur Untersuchung im Zusammenhang mit dem Darm Zellwanderung erfordert die Isolierung des Darm-assoziierten Zellen, gefolgt von einen Adoptiv-Transfer in Empfänger Mäuse zu bestimmen, ihre Gewebe-Homing-Muster und<sup class="x...

Der Säugetiere Magen-Darm-Trakt beherbergt Hunderte von Arten von Bakterien, die in einer symbiotischen Beziehung mit dem Host1vorhanden sind. Die Immunzellen vorhanden im lokalen Umfeld ein friedliches Zusammenleben mit dieser Mikroben zu erzwingen und eine schützende Barriere gegen Erreger Invasionen zu etablieren. Bi-direktionale Interaktionen zwischen den Immunzellen und die Mikrobiota sind so entscheidend für eine Kommensale Gemeinschaft zu etablieren, die bildet das Immunsystem des Wirts und setzt die Schwelle für immune Reaktivität gegenüber Krankheitserregern. Änderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung oder Dysbiose, stören die Immunsystem Homöostase und Radardetektoren Regelkreise, die Darm-Entzündungen zu immunvermittelte Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und IBD2,3 zurückhalten .
Die Zeit unmittelbar nach der Geburt eine einmalige Entwicklung in der intestinalen mikrobiellen Gemeinschaften beginnen, zur gleichen Zeit das Immune System zu etablieren reift4. Die postnatale Mikrobiota ist nicht stabil, mit Verschiebungen in der Zusammensetzung natürlich vorkommenden und häufig5. Die Immunzellen, die Interaktion mit der Mikrobiota befinden sich in zwei unterschiedlichen anatomischen Standorten im Darm - Lamina Propria und dem Darmepithel6. Zahlreiche Arten von Immunzellen sind im Darm, einschließlich Lymphozyten (z. B. T-Zellen, B-Zellen und angeborene Lymphzellen) sowie myeloische Zellen (die dendritischen Zellen, Monozyten und Makrophagen enthalten). Diese Zellen, auch bekannt als hämatopoetischen Zellen führen eine Vielzahl von Funktionen, die bewahren die Darmbarriere und Homöostase aufrechtzuerhalten.
Neben ihrer regulatorischen Funktionen im Darm Websites können immune Zellen der Schleimhaut auch mikrobielle Nachrichten zu den extra Darm Sites, systemische Immunität7,8,9Regeln durchführen. Dies ist ein Bereich des wachsenden Forschungsinteresses und unterstreicht die Notwendigkeit der Methoden zur Ermittlung von Immunzellen, die aus intestinalen Gewebe migrieren, um ihre Funktion zu prüfen. Das Protokoll hier berichtet nutzt eine handelsübliche Maus-Modell in dem ein Photoconvertible fluoreszierendes Protein Label Zellen genutzt wird. PhAMherausgeschnitten Mäuse express ubiquitär ein grünes fluoreszierendes Dendra2 Protein, das irreversibel auf rote Fluoreszenz bei Aktivierung durch ultraviolette (UV) Licht10umgestiegen ist. Verwenden eine Faser-Optik-Kanüle, um 405 nm Licht in den Darm des Neugeborenen Mäusen zu liefern, zeigen wir, dass die Photoconverted hämatopoetischen Zellen, die ihren Ursprung in oder Durchreise durch den Darm in der Milz gefunden werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Laser</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Light Emitting Diode (LED)</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M405FP1</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">LED driver</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:247px;">Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Optogenetics patch cable</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M87L01</td>
			<td style="width:247px;">1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&#38;pn=M87L01#11454</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Fiber optic cannula</td>
			<td style="width:201px;">Doric lenses&#160;</td>
			<td style="width:167px;">MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td>
			<td style="width:247px;">5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &#181;m and an inner diameter of 480 &#181;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Power supply</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">KPS101</td>
			<td style="width:247px;">Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">LG3 laser safety goggles&#160;</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LG3</td>
			<td style="width:247px;">Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&#38;pn=LG3#2523</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Red light&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74327-10</td>
			<td style="width:247px;">15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Intestinal cell isolation</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:201px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:167px;">07-893-1389</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&#160; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">1X HBSS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">14025076</td>
			<td style="width:247px;">Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&#38;searchTerm=14025076&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=14025076</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Calf Serum</td>
			<td style="width:201px;">Hyclone AZM</td>
			<td style="width:167px;">197696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">EDTA</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">15575020</td>
			<td style="width:247px;">0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">DTT</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10197777001</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">15630080</td>
			<td style="width:247px;">1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Petri dish</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">353004</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&#38;searchTerm=08772F&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=08772F</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">70 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Micro magnetic stir bar</td>
			<td style="width:201px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:167px;">1451364</td>
			<td style="width:247px;">Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:201px;">Corning Laboratory Stirrers</td>
			<td style="width:167px;">440826</td>
			<td style="width:247px;">https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&#38;persist=true&#38;ip=no&#38;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Collagenase</td>
			<td style="width:201px;">Roche</td>
			<td style="width:167px;">5401020001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&#38;region=US&#38;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">DNase I</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10104159001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">1X PBS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">20012-027</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">Pipet aid</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">14387165</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357530</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">25 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357515</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339651</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339653</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Single cell suspension</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:201px;">Seal-Rite</td>
			<td style="width:167px;">1615-5500</td>
			<td style="width:247px;">Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Tissue homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td>K7495400000</td>
			<td style="width:247px;">Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Homogenizer tips&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td style="width:167px;">7495210590</td>
			<td style="width:247px;">Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">A10492-01</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">40 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">08-771-1</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Antibodies</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">BV786 anti-mouse CD45&#160;</td>
			<td style="width:201px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">564225</td>
			<td style="width:247px;">Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Live/Dead</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Other</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:247px;">Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

Magensaftresistente bakteriengemeinschaften sind schon früh im Leben etabliert und Immunzelle Entwicklung und Funktion zu beeinflussen. Die neonatale Mikrobiota ist anfällig für zahlreiche äußere Einflüsse, einschließlich Antibiotika-Einsatz und Ernährung, die Anfälligkeit für Autoimmun-und Entzündungserkrankungen auswirkt. Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit (IBD) zeichnen sich durch einen massiven Zustrom von Immunzellen in den Darm. Immunzellen, die bedingt durch die Mikrobiota können jedoch zusätzlich aus den Darm zu beeinflussen Immunreaktionen an extra Darm Standorten auswandern. So, gibt es eine Notwendigkeit zu identifizieren und zu charakterisieren, Zellen, die mikrobielle Nachrichten aus dem Darm zu distalen Seiten tragen können. Hier beschreiben wir eine Methode, um beschriftungszellen in den Darm des Neugeborenen Mäusen in Vivo , die ihre Identifizierung an extra Darm Standorten nach der Migration ermöglicht.

Ein LWL-Kabel wurde verwendet, um 405 nm Licht in die Doppelpunkte der 2 - Tage alten PhAMherausgeschnitten Mäuse zu liefern. In bisherigen Experimenten wurde eine 30 s Belichtung entschlossen, einen maximalen Ladungszustand der Doppelpunkt Zellen mit minimalen Zytotoxizität (Abb. 1A) zu geben. Daher wurden sequenziellen 30 s Forderungen der verschiedenen Segmente des Dickdarms durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Im Ansc...

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Das hier beschriebene Protokoll nutzt einen Photolabeling Ansatz bei Neugeborenen Mäusen gezielt Immunzellen identifizieren, die aus dem Dickdarm in extra Darm Websites auszuwandern. Diese Strategie werden Host-Microbiome Interaktionen in den ersten Lebensjahren zu untersuchen.

In Vivo Photolabeling von Zellen im Darm wandernden Potential der hämatopoetischen Zellen bei Neugeborenen Mäusen zu bewerten

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital. Das hier beschriebene Protokoll nutzt einen Photolabeling Ansatz bei Neugeborenen Mäusen gezielt Immunzellen identifizieren, die aus dem Dickdarm in extra Darm Websites auszuwandern. Diese Strategie werden Host-Microbiome Interaktionen in den ersten Lebensjahren zu untersuchen.

Serie: In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Forschung

Medizin

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

Mammary Transplantation von Stromazellen und Carcinoma Cells in C57BL/6J-Mäuse

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Intrauterine Telemetrie zur Maus Kontraktionsdruck messen<em&gt; In-vivo-</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

In Vivo Photolabeling von Zellen im Darm wandernden Potential der hämatopoetischen Zellen bei Neugeborenen Mäusen zu bewerten

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