Name: in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

Nitya Jain wurde durch ein NIH/NIAID Career Transition Award-1K22AI116661-01 unterstützt.

Alle tierische Verfahren wurden mit Zustimmung und unter Einhaltung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital durchgeführt.
Achtung: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von einem Laser der Klasse 3 b (LG3). LG3 Laserschutzbrillen müssen immer verwendet werden, wenn diese Laser in Betrieb. Entsprechende Schulung und Sicherheit Richtlinien befolgt werden, um das Risiko von Verletzungen zu vermeiden.
1. Aufbau und Montage von Laser
<ol><li>Schließen Sie die Leuchtdiode (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fasergekoppelte) der LED-Treiber über die 4-polige M8 Stecker Kabel, das kommt beigefügt, die LED. Sorgfältig die Schraube um die Verbindung zu befestigen.</li>
	<li>Vor dem Anbringen der optogenetik Patchkabel an die LED, halten Sie den Connector Öffnung der LED für das Licht, um sicherzustellen, dass keine sichtbare Hindernisse sind. Schlag auf das Loch, alle Hindernisse zu beseitigen, falls erforderlich und die optogenetik Patch-Kabel in die Öffnung einführen.</li>
	<li>Schließen Sie Fiber optic Kanüle durch einführen der Kanüle in beiden Enden der Steckverbinder Hülse an die optogenetik Patch-Kabel an. Legen Sie das andere Ende des Ärmels Connector auf Patch-Kabel.  Genügend Druck zu sichern die Verbindung aber nicht verbiegen oder brechen die optische Faser in die Kanüle vorsichtig sein. Hinweis: Die fragile Fiber optic Kanüle wird mit der Schutzkappe behandelt, wenn der Laser nicht benutzt wird.</li>
	<li>Stellen Sie die LED-Treiber in den kontinuierliche Welle (CW) Modus mit den kontinuierlichen Einstellknopf auf 0 und die Strombegrenzung auf 1,2 A. festgelegt</li>
</ol>(2) Ladungszustand der Zellen im Darm
Hinweis: Männliche und weibliche Mäuse wurden Intracolonic 405 nm Licht noch 1-2 Tage nach ihrer Geburt ausgesetzt und wurden geopfert, vor 1 Woche alt.
<ol><li>Einem dunklen Ort mit einem Zugang zu einer Steckdose zu sichern. Schließen Sie das LED-Netzteil an die Steckdose. Hinweis: Dieses Verfahren erfolgt in dem minimalen weißen Licht wie eine längere Belichtung der Mäuse an das Umgebungslicht eine unerwünschte Ladungszustand der Zellen führen kann. Rotes Licht wird als Alternative verwendet. Achtung: Der folgende Schritt bezieht den Gebrauch eines Tieres Narkose. Die Verwaltung des Betäubungsmittels erfolgt in Klasse II Kapuze oder mithilfe einer anderen geeigneten Aufräumvorgang Systems. Die Inhalation des Betäubungsmittels kann Schwindel, Benommenheit oder sogar Bewusstlosigkeit führen.</li>
	<li>Die Maus durch die Einwirkung von 4-5 % Isofluran in 100 % O2 in einer Induktion-Box zu betäuben. Überprüfen Sie richtige Tiefe der Narkose durch fest Kneifen eine Hinterpfote (keine Antwort). Pflegen Sie Anästhesie über eine bugnase bei ca. 2 % Isofluran. Verhindern Sie Handler Exposition gegenüber Isofluran durch Verwendung einer geeigneten Haube oder Narkose Aufräumvorgang Gerät.</li>
	<li>Position der narkotisierten Maus für die Intracolonic Belichtung mithilfe von 1 hand Scruff die Rückseite der Maus sanft mit dem Zeigefinger und dem Daumen. Schalten Sie die Maus über den Bauch aussetzen. Lösen Sie den Griff, wenn die Maus fängt an, seine rosa Farbe verlieren oder ihre Atemfrequenz beginnt sich zu verlangsamen. Sichern Sie das Ende der Maus zwischen dem Ring und kleinen Finger.</li>
	<li>Entfernen Sie mit der anderen Hand die Schutzkappe von der Kanüle. Unter Beibehaltung der Längsachse parallel zur Mittellinie der Maus, der Kanüle sanft legen Sie Fiber optic Kanüle durch den Anus in den Darm so, dass alle 5 mm der Lichtleitfaser sind im Inneren der Maus. Hinweis: Dieser Vorgang erfolgt langsam und mit Sorgfalt nicht auf die Kolon Wand zu perforieren. Minute wackeln und Verdrehen der Kanüle hilft bei die Weiterentwicklung in den Darm.</li>
	<li>Don die Schutzbrille und erhöhen Sie den Laser auf den maximalen Wert (ganz im Uhrzeigersinn). Bestätigen Sie die Anwesenheit von UV-Licht durch das Betrachten des transluzenten Bauches der Maus. Hinweis: Die LG3 Laserschutzbrillen verringern drastisch Sichtbarkeit. Haben ein Kollege (tragen Schutzausrüstung) helfen bei der Brille anziehen und Einschalten des Lasers.</li>
	<li>Setzen Sie dem Doppelpunkt, das Laserlicht für insgesamt 2 min. zurückziehen der Kanüle ca. 1 mm alle 30 s, der luminalen Umgebung ausgesetzt, das Licht zu maximieren. Am Ende von 2 min schalten Sie den Laser aus.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kanüle langsam von der Maus. Nach der Genesung von Anästhesie in einem leeren Käfig warm, die Maus zu Hause Käfig zurück</li>
</ol>3. Isolation von Darm-Lymphozyten
<ol><li>Bereiten Sie 1 L die Hank ausgewogen Salz Lösung/Kalb Serum (HBSS/CS) Puffer, 200 mL von epithelialen Streifen Puffer, 500 mL waschen Medien und 200 mL Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)-freie Medien zu waschen. Hinweis: Die Reagenz Mengen sind für eine Stichprobengröße von 9 berechnet.<ol>
<li>Machen Sie den HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS) durch Zugabe von 50 mL CS bis 950 mL HBSS. Bewahren Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Vorbereiten des epithelialen Streifen Puffers [HBSS; 5 % CS; 5 mM EDTA; 1 mM Dithiothreitol (DTT), 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES) (pH 7,2-7,5)] durch Zugabe von 10 mL CS 200 µL des DVB-t, 2 mL 0,5 M EDTA und 3 mL 1 M HEPES-Puffer 1 M bis 185 mL von HBSS. Ort der epithelialen Streifen-Puffer in einem 37 ° C-Wasserbad.</li>
		<li>Machen Sie waschen-Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA) durch Zugabe von 5 mL CS und 1 mL 0,5 M EDTA auf 494 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie die EDTA-freie Wäsche Medien (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES vor) durch Zugabe von 2 mL CS und 3 mL 1 M HEPES auf 195 mL HBSS. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Machen einen FACS-Puffer [1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,2); 2 % CS] durch Zugabe von 10 mL CS bis 490 mL PBS. Bewahren Sie es auf dem Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie das Gewebe Sammlung Gericht, indem man ein 70 µm Zelle Sieb in der Kulturschale 60 x 10 mm. Das Gericht 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 hergestellt und auf Eis gelagert) hinzu, und legen Sie es auf dem Eis.</li>
	<li>Der Maus über eine Überdosierung von inhalativen Isofluran mit entsprechenden Aufräumvorgang von Narkose einschläfern (ein ca. 3 min Exposition gegenüber > 4 % Isofluran in der Raumluft oder 100 % O2). Nach dem scheinbaren Einstellung der Atmung und reflex-Bewegung, die Abwesenheit von tiefen Schmerz durch eine Hinterpfote fest kneifen zu überprüfen (mit Pinzette wird empfohlen). Stellen Sie sicher der Euthanasie über eine Enthauptung mit der Chirurgische Schere oder ein neues Rasiermesser. Hinweis: Zervikale Dislokation empfiehlt sich nicht für diesen Schritt aufgrund der Größe und Alter des Tieres. Diese Methoden sind im Einklang mit den 2013 AVMA Richtlinien über Sterbehilfe und von der MGH IACUC genehmigt.</li>
	<li>Ernten Sie den Doppelpunkt mit saubere Zange und Schere um den Bauch zu öffnen. Spiegeln Sie den Darm zu 1 Seite der Maus Abdomen Dickdarm aussetzen. Entfernen Sie den gesamten Dickdarm durch erste transecting es nur distal (in Richtung des Afters), der Blinddarm. Verwenden Sie dann während fest greifen den Darm mit der Pinzette, Schere, Schneiden durch die Harnröhre, den Enddarm. Schneiden Sie den Doppelpunkt als in der Nähe des Afters wie möglich. Ernte die Milz nach dem Entfernen des Dickdarms (siehe Schritte 4.1-4.2 unten). Hinweis: Während der Ladungszustand Protokoll nur ~ 25 % der Neugeborenen Colon (5 mm der Fiber optic Kanüle) richtet, ist der gesamte Dickdarm geerntet, um die Zelle isoliert zu unterstützen.</li>
	<li>Reinigen Sie den Doppelpunkt mit Zange um den Inhalt aus dem Dickdarm und auf einem trockenen Papiertuch zu schieben. Das Gewebe mit Rasierklingen fein hacken des Dickdarms zu einer Paste auf dem Cover von einer Kulturschale und übertragen diese Paste in die Zelle Sieb in der Petrischale zu homogenisieren.</li>
	<li>Fügen Sie eine saubere 8 mm lange magnetische Stir Bar in das Sieb und legen Sie die Schüssel auf einen 9-Position Magnetrührer Teller. Die magnetische Stir Bar Geschwindigkeit auf 800 u/min und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Den Puffer zu verwerfen und mit 10 mL HBSS/CS (die HBSS; 5 % CS Puffer im Schritt 3.1.1 vorgenommen und gespeichert auf dem Eis) zu wiederholen. Verwerfen Sie den Puffer am Ende des SPÜLPROGRAMMS.</li>
	<li>Die Epithelzellen durch Zugabe von 10 mL vorgewärmte epithelialen Streifen Puffer (die HBSS 5 % CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM HEPES [pH 7,2-7,5] Puffer, der war im Schritt 3.1.2 hergestellt und gelagert in einem Wasserbad von 37 ° C) in die Zelle Sieb zu distanzieren und bei 800 u/min für 30 min in einem 3 rühren 7 ° C Inkubator. Am Ende der Inkubation übertragen des Puffers bereichert in der epithelialen Fraktion um eine saubere 15 mL-Tube. Hinweis: Das Epithel und die zugehörigen Zellen (intestinale Epithelzellen und der intestinalen epithelialen Lymphozyten) sind in den Puffer veröffentlicht, während die Zellen in die intakte Lamina Propria auf die Zelle Sieb während dieser Schritt11bleiben.<ol>
<li>Zentrifugieren Sie den angereicherten intestinalen epithelialen Bruch (Lal) 700 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL der FACS-Puffer. Bewahren Sie es auf dem Eis für Schritt 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschen den Lamina Propria Bruch innerhalb der Zelle Sieb 2 X mit HBSS/CS. Dazu die Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Lösung (HBSS; 5 % CS Puffer, die im Schritt 3.1.1 gemacht wurde, die auf dem Eis gespeichert wurden) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe 2 X Waschen Medien. Die Zelle Sieb 10 mL waschen Medien (HBSS, 1 % CS, 1 mM EDTA Puffer, die im Schritt 3.1.3 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 15 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.<ol>
<li>Bewahren Sie nach der Verwendung waschen Medien es auf dem Eis für den Einsatz im Schritt 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS Zelle Sieb 10 mL HBSS/CS-Puffer (HBSS; 5 % CS Puffer in 3.1.1 Schritt gemacht, der auf dem Eis gespeichert wurde) hinzu und rühren Sie es mit 800 u/min für 5 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gewebe in EDTA-freie Waschpuffer. Fügen Sie 10 mL EDTA-freie Waschpuffer (HBSS; 1 % CS 15 mM HEPES-Puffer, der in Schritt 3.1.4 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert wurde) in die Zelle Sieb und inkubieren Sie die Platte für 10 min bei Raumtemperatur ohne sich zu rühren. Verwerfen Sie den Puffer am Ende dieses Schrittes.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe 2 X mit HBSS/CS und bereiten Sie die Enzymlösung. Fügen Sie 10 mL HBSS/CS (HBSS; 5 % CS Puffer gemacht synchron 3.1.1 auf Eis gespeichert wurde) in die Zelle Sieb Puffern und rühren Sie es mit 800 u/min für 10 min in einem Inkubator 37 ° C. Verwerfen Sie den Puffer nach jedem Waschen.<ol>
<li>Vorbereiten der Enzymlösung (EDTA-frei waschen Puffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase) während der zweiten Periode waschen: 9 mg hinzufügen der DNase I und 15 mg gefriergetrockneten Kollagenase, 90 mL EDTA-freie Puffer waschen. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Lamina Propria Bruchteil enthalten in der Zelle Sieb Lamina Propria Lymphozyten (Vormerkung) zu verdauen. Fügen Sie 10 mL der Enzymlösung (EDTA-freie Waschpuffer; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL Kollagenase Puffer in Schritt 3.12.1 gemacht und bei Raumtemperatur gelagert) in die Zelle Sieb und rühren Sie es mit 800 u/min für 45 min in einem Inkubator 37 ° C. Hinweis: Vormerkung gelangen in die Lösung nach der enzymatischen Verdauung.<ol>
<li>Sammeln Sie das Enzym-Lösung enthält die Zellen zu und Filtern sie durch eine neue Zelle Sieb in ein 50 mL konische Röhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Die gefilterten Zellen zu blockieren, die Kollagenase-Aktivität in der Enzymlösung fügen Sie 20 mL kaltwäsche Medien (die HBSS; 1 % CS; 1mM EDTA Puffer im Schritt 3.1.3 gemacht und gespeichert auf dem Eis im Schritt 3.9.1 hinzu). Zentrifugieren Sie das Rohr auf 700 X g für 6 min bei Raumtemperatur. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Pellets, die Vormerkung in 1 mL der FACS-Puffer enthalten.</li>
	<li>Kombinieren Sie IEL (aus Schritt 3.7.1) und die LPL (aus Schritt 3.14) Brüche und Färben sie mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5). Hinweis: IEL und LPL Fraktionen können separat gefärbt werden, wenn Fach Informationen gewünscht wird.</li>
</ol>4. Isolierung von Lymphozyten aus der Milz
<ol><li>Bereiten Sie das sammelröhrchen durch Zugabe von 500 µL FACS Puffer zu einem Microcentrifuge Schlauch. Bewahren Sie es auf dem Eis.</li>
	<li>Nach dem Entfernen des Dickdarms (Schritt 3.4), Ernten Sie die ganze Milz und legen Sie sie in das sammelröhrchen. Speichern Sie das Gewebe auf dem Eis.</li>
	<li>Mit Hilfe einer elektrischen Gewebe-Homogenisator, Homogenisieren der Milz in einem Microcentrifuge Schlauch für ca. 1 min. Zentrifuge der Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.</li>
	<li>Führen Sie die Lyse der roten Blutkörperchen durch resuspending der Probenmaterials in 500 µL Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer, Zelltod durch osmotische Lyse zu initiieren. Lassen Sie die Probe 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren und es dann in 725 µL FACS Puffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand. Aufschwemmen Sie das Pellet in 500 µL Puffer FACS und Filtern sie durch ein Sieb 40 µm Zelle zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch. Die gesamte Probe zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen und Färben Sie es mit Leuchtstoff-konjugierten Antikörpern für die durchflusszytometrischen Analyse (siehe Schritt 5).</li>
</ol>5. Identifizierung von Dendra-R+ Zellen mittels Flow Cytometry
<ol><li>Zentrifugieren Sie IEL/LPL und Milz Proben bei 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur und Absaugen aus der Überstand.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie die Pellets in 100 µL Antikörper Färbung Mischung. Vorbereiten des Antikörpers Färbung Mischung durch Zugabe von 1 µL eindringmittel konjugierten Anti-CD45 Antikörper zu 100 µL FACS Puffer pro Probe. Hinweis: Es ist wichtig, die Antikörper für die Durchflusszytometrie vor dem Experiment zur Bestimmung der optimalen Konzentration wo tritt verbindlich Sättigung verwendet titrieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben auf Eis (an einem dunklen Ort) 35 min.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie die Proben in 300 µL Puffer FACS und Zentrifugieren sie 300 X g [Mikro-Zentrifuge] für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Proben in 325 µL FACS-Puffer. Analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Identifizierung und Charakterisierung von Zellen, die Interaktion mit und sind beeinflusst durch die Mikrobiota im Dickdarm sind wichtig und sollten erleichtern Überblick darüber, wie Informationen aus der Schleimhaut Mikroumgebung für den Rest des Körpers weitergeleitet wird. Eine Methode zur Untersuchung im Zusammenhang mit dem Darm Zellwanderung erfordert die Isolierung des Darm-assoziierten Zellen, gefolgt von einen Adoptiv-Transfer in Empfänger Mäuse zu bestimmen, ihre Gewebe-Homing-Muster und<sup class="x...

Der Säugetiere Magen-Darm-Trakt beherbergt Hunderte von Arten von Bakterien, die in einer symbiotischen Beziehung mit dem Host1vorhanden sind. Die Immunzellen vorhanden im lokalen Umfeld ein friedliches Zusammenleben mit dieser Mikroben zu erzwingen und eine schützende Barriere gegen Erreger Invasionen zu etablieren. Bi-direktionale Interaktionen zwischen den Immunzellen und die Mikrobiota sind so entscheidend für eine Kommensale Gemeinschaft zu etablieren, die bildet das Immunsystem des Wirts und setzt die Schwelle für immune Reaktivität gegenüber Krankheitserregern. Änderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung oder Dysbiose, stören die Immunsystem Homöostase und Radardetektoren Regelkreise, die Darm-Entzündungen zu immunvermittelte Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und IBD2,3 zurückhalten .
Die Zeit unmittelbar nach der Geburt eine einmalige Entwicklung in der intestinalen mikrobiellen Gemeinschaften beginnen, zur gleichen Zeit das Immune System zu etablieren reift4. Die postnatale Mikrobiota ist nicht stabil, mit Verschiebungen in der Zusammensetzung natürlich vorkommenden und häufig5. Die Immunzellen, die Interaktion mit der Mikrobiota befinden sich in zwei unterschiedlichen anatomischen Standorten im Darm - Lamina Propria und dem Darmepithel6. Zahlreiche Arten von Immunzellen sind im Darm, einschließlich Lymphozyten (z. B. T-Zellen, B-Zellen und angeborene Lymphzellen) sowie myeloische Zellen (die dendritischen Zellen, Monozyten und Makrophagen enthalten). Diese Zellen, auch bekannt als hämatopoetischen Zellen führen eine Vielzahl von Funktionen, die bewahren die Darmbarriere und Homöostase aufrechtzuerhalten.
Neben ihrer regulatorischen Funktionen im Darm Websites können immune Zellen der Schleimhaut auch mikrobielle Nachrichten zu den extra Darm Sites, systemische Immunität7,8,9Regeln durchführen. Dies ist ein Bereich des wachsenden Forschungsinteresses und unterstreicht die Notwendigkeit der Methoden zur Ermittlung von Immunzellen, die aus intestinalen Gewebe migrieren, um ihre Funktion zu prüfen. Das Protokoll hier berichtet nutzt eine handelsübliche Maus-Modell in dem ein Photoconvertible fluoreszierendes Protein Label Zellen genutzt wird. PhAMherausgeschnitten Mäuse express ubiquitär ein grünes fluoreszierendes Dendra2 Protein, das irreversibel auf rote Fluoreszenz bei Aktivierung durch ultraviolette (UV) Licht10umgestiegen ist. Verwenden eine Faser-Optik-Kanüle, um 405 nm Licht in den Darm des Neugeborenen Mäusen zu liefern, zeigen wir, dass die Photoconverted hämatopoetischen Zellen, die ihren Ursprung in oder Durchreise durch den Darm in der Milz gefunden werden können.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Laser&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetics patch cable</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optic cannula</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &amp;micro;m and an inner diameter of 480 &amp;micro;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 laser safety goggles&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Red light&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intestinal cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Micro magnetic stir bar</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single cell suspension&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homogenizer tips&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

Magensaftresistente bakteriengemeinschaften sind schon früh im Leben etabliert und Immunzelle Entwicklung und Funktion zu beeinflussen. Die neonatale Mikrobiota ist anfällig für zahlreiche äußere Einflüsse, einschließlich Antibiotika-Einsatz und Ernährung, die Anfälligkeit für Autoimmun-und Entzündungserkrankungen auswirkt. Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit (IBD) zeichnen sich durch einen massiven Zustrom von Immunzellen in den Darm. Immunzellen, die bedingt durch die Mikrobiota können jedoch zusätzlich aus den Darm zu beeinflussen Immunreaktionen an extra Darm Standorten auswandern. So, gibt es eine Notwendigkeit zu identifizieren und zu charakterisieren, Zellen, die mikrobielle Nachrichten aus dem Darm zu distalen Seiten tragen können. Hier beschreiben wir eine Methode, um beschriftungszellen in den Darm des Neugeborenen Mäusen in Vivo , die ihre Identifizierung an extra Darm Standorten nach der Migration ermöglicht.

Ein LWL-Kabel wurde verwendet, um 405 nm Licht in die Doppelpunkte der 2 - Tage alten PhAMherausgeschnitten Mäuse zu liefern. In bisherigen Experimenten wurde eine 30 s Belichtung entschlossen, einen maximalen Ladungszustand der Doppelpunkt Zellen mit minimalen Zytotoxizität (Abb. 1A) zu geben. Daher wurden sequenziellen 30 s Forderungen der verschiedenen Segmente des Dickdarms durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Im Ansc...

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Das hier beschriebene Protokoll nutzt einen Photolabeling Ansatz bei Neugeborenen Mäusen gezielt Immunzellen identifizieren, die aus dem Dickdarm in extra Darm Websites auszuwandern. Diese Strategie werden Host-Microbiome Interaktionen in den ersten Lebensjahren zu untersuchen.

In Vivo Photolabeling von Zellen im Darm wandernden Potential der hämatopoetischen Zellen bei Neugeborenen Mäusen zu bewerten

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital. Das hier beschriebene Protokoll nutzt einen Photolabeling Ansatz bei Neugeborenen Mäusen gezielt Immunzellen identifizieren, die aus dem Dickdarm in extra Darm Websites auszuwandern. Diese Strategie werden Host-Microbiome Interaktionen in den ersten Lebensjahren zu untersuchen.

Serie: In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biologie

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Verwenden Sie von<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging zur Überwachung der Progression of Experimental Maus Cytomegalovirus-Infektion bei Neugeborenen

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Immunologie und Infektion

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Krebsforschung

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Medizin

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo Photolabeling von Zellen im Darm wandernden Potential der hämatopoetischen Zellen bei Neugeborenen Mäusen zu bewerten

Zusammenfassung

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Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Analyzing

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Verwenden Sie von

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In Vivo Photolabeling von Zellen im Darm wandernden Potential der hämatopoetischen Zellen bei Neugeborenen Mäusen zu bewerten

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Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Analyzing

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Verwenden Sie von

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte