Tüm mevcut ve eski Kunkel laboratuvar Üyeler kendi çalışmaları için teşekkür ediyoruz ve tartışmaları ile ilgili protokolü için ve burada sunulan verileri yeniden. Bu eser proje Z01 ES065070 tarafından bölümü, Intramural araştırma--dan Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) Enstitüleri T.A.K. için destek verdi.

1. alkali hidroliz ve Strand özgü Southern Blot (Şekil 1)
<ol><li>Hücre büyümesi ve genomik DNA izolasyon<ol>
<li>Bir Maya DNA arıtma kit üreticinin talimatları kullanarak Maya genomik DNA izole et. Üstel büyüme (0,5 bir optik yoğunluk) ile 1 arasında aşamasında olan kültürler kullanın. Son DNA Pelet 35 ml 1 x TE arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)) resuspend.</li>
		<li>DNA'yı 5 mg/mL RNase A 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
		<li>3 M sodyum asetat (pH 5.2) 0.1 birimleri kullanma DNA çökelti ve %2.5 100 etanol için buz üzerinde 20 dk hacimleri.</li>
		<li>4 ° C'de 20 dk için 16.000 x g, santrifüj Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Pelet iki kez 500 mL % 70 etanol ile yıkayın. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Pelet bankta kuru ve 35 ml 1 x TE arabellek resuspend.</li>
		<li>Bir fluorimeter (Malzeme tablo) dsDNA BR tahlil kiti ile kullanarak DNA quantitate.</li>
		<li>DNA 5 mg 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve 2.5 birimleri %100 0.1 birimleri kullanma her örnekten çökelti alkol için 200 mL toplam hacmi (H2O tarafsız jel denetim gerekli ise DNA'ın gerekli, ek 5 mg gerekirse ekleyin). 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>4 ° C'de 20 dk için 16.000 x g, santrifüj Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Pelet bankta kuru. DNA 14 mL H2O. resuspend</li>
	</ol></li>
	<li>Alkalin hidroliz ve jel elektroforez<ol>
<li>1 M KOH 6 mL ekleyin ve 55 ° c 2 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Örnekleri 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>6 x alkalin DNA yükleme arabellek 4 mL ekleyin: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, % 18 polysucrose (Malzeme tablo), % 0.15 bromocresol yeşil ve % 0.25 ksilen cyanol FF.</li>
		<li>% 1'özel, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0 oluşan bir alkali jel döküm. DNA örneği için 24 mL lane yüklenmesine olanak sağlar bir tarak kullanın.</li>
		<li>1 x alkalin Elektroforez arabellek içinde oda sıcaklığında jel çalıştırın: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Uygun bir DNA boyutu işaretleyici içerir.</li>
		<li>Kısaca tüpler spin ve tüm 24 mL örnek Alkalin özel jel yükleyin. 30 V, 18-20 h tarafından 10 V izleyen 30 dk için electrophorese.</li>
		<li>45 dk her nazik ajitasyon nötralizasyon tampon ı: 1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl ile Oda sıcaklığında 2 incubations için jel etkisiz hale getirin.</li>
		<li>DNA'yı etkisiz jel 200 mL su 1/10.000 seyreltme nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 2 h için SYBR altın leke, içeren ıslatarak leke.</li>
		<li>UV transilluminator kullanarak DNA görselleştirin. Alkali duyarlılık arttı DNA5düzeltilmemiş ribonucleotides daha yüksek yoğunluğu gösteren daha küçük DNA parçalarının görünümünü neden olur.</li>
	</ol></li>
	<li>Güney transfer<ol>
<li>DNA alkalin jel kılcal eylem10tarafından pozitif yüklü naylon membran için transfer. Nasıl bu transfer ayarlanabilir bir örnek Sambrook ve Russell'ın el ile10içinde sağlanır.</li>
		<li>Alkali aktarım arabellek içinde oda sıcaklığında 15dk için alkali jel emmek: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>(Jel boyutuna kesme) naylon membran kısaca su ile ıslak ve daha sonra 5 dakika içinde alkalin aktarım arabellek için emmek.</li>
		<li>Aktarım platformu 3 cam şişeler (100 mL) ters çevirme yemek pişirme bir cam ayarlayın. Bu yemek biraz özel jel boyutundan daha büyük olmalıdır. Bir cam levha onları üst üzerinde ayarlayın.</li>
		<li>3 MM CHR Kromatografi kağıt (jel artı kenarları üzerinde arabellek göle asmak uzun taraf genişliğini boyutuna kesme) 2 büyük parçaları üzerinde cam levha asmak.</li>
		<li>Alkali aktarım arabellek Kromatografi kağıt ve yarım dolgu cam tabak üzerine dökün. 5 mL Cam Pipet kullanarak kabarcıklar dışarı pürüzsüz.</li>
		<li>Üzerine tekrar kabarcıklar yumuşatma, özel jel yerleştirin. Jel parafilm ile tüm kenarlarını çevreleyen. Alkali aktarım arabellek az miktarda jel üzerine dökün.</li>
		<li>Öncesi naylon membran jel üstüne yerleştirin. Baloncuklar dışarı pürüzsüz.</li>
		<li>Kağıt ıslak 2 adet özel jel boyutuna kesme. Onları membran üstüne yerleştirin ve herhangi bir kabarcıklar pürüzsüz.</li>
		<li>Büyük bir yığın kağıt havlu (kesim özel jel biraz daha büyük bir boyuta) aktarım sandviç üstüne yerleştirin. Dikkatle kağıt havlu üzerine bir cam plaka yer. Üst (bir kitle 400 g çalışır kitapla) ağırlıklı bir nesne ekleyin.</li>
		<li>Gecede oda sıcaklığında devam transfer izin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde transfer yığın ayrı almak ve nötralizasyon arabellek II oda sıcaklığında membran 15dk için emmek: 0,5 M Tris-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Crosslink UV crosslinker kullanarak şarj edilmiş naylon membran için DNA. Membran cross-linker ve autocrosslink ayarını kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Güney soruşturma hazırlık Not: bir protokol tabanlı doğmakta olan lider-ahşap kaplama iplikçikli DNA iplikçiğinin karşı alkali duyarlı siteleri bulmak için burada açıklanan yaklaşım daha önce11yayınlandı. Deneyimiz için sondalama adlı bir iki yönler (OR1 veya OR2) kromozom III (Şekil 3A) ARS306 çoğaltma köken bitişik eklenen URA3 muhabir gen gerçekleştirdi. Alkali duyarlı siteleri Maya genomik DNA'varlığı ribonucleotide birleşme, DNA polimeraz etkinlik12,13,14biyolojik ribonucleotides kullanımına izin veren bir göstergesidir. Bu yaklaşım, bir hedef DNA dizisi çoğaltma, verimli ARS306 kökeni bitişik kullanarak diğer genomik mekanlar ve hedef genlerin de mükellef olmalıdır.<ol>
<li>PCR-yükseltmek 520-baz çifti kesimi aşağıdaki astar çiftini kullanarak URA3 muhabir gen: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) ve URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>10-20 ng bir şablon olarak Maya genomik DNA'ın, her astar (10 μm kalınlığında hisse senedi) 10 x Taq arabellek Ex (Mg2 + artı işareti), 8 μL dNTP karışımı (2.5 mM her), 0,5 μL in Ex Taq DNA polimeraz 10 μL 4 μL kullanarak PCR reaksiyonu gerçekleştirmek (5 U/μL) ve H2o 100 μL için son ses seviyesini</li>
		<li>Aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 30 döngüleri 95 ° c için 1 dakika, 55 ° C için 1 dakika, 2 dk 72 ° C; 10 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C</li>
		<li>PCR arıtma seti kullanarak PCR ürünü arındırmak ve 50 mL H2O. kullanarak DNA elute Bu şimdi radiolabeling tepki olarak şablon olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Strand özel radiolabeling için aşağıdaki astar kullanın: sonda A. anneals DNA görüntülenmesi için kullanım URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) URA3 OR2 ve URA3 OR1 içinde olduğunda iplikçik DNA kalmış tnascent olduğunda bu da doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA karşılık gelir. URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) prob B. anneals doğmakta olan DNA görüntülenmesi için kullanın URA3 OR2 içinde olduğunda OR1 ve doğmakta olan ahşap kaplama iplikçik DNA URA3 olduğunda bu da doğmakta olan önde gelen iplikçik DNA karşılık gelir (Şekil 3).<ol>
<li>Şablon DNA, astar (10 μm kalınlığında hisse senedi), 10 x Taq arabellek (Mg2 + artı) Ex 5 μL, 2.5 mM dNTPs (dCTP), eksi 4 μL 2 μL olarak 10-20 ng güçlendirilmiş URA3 parçası kullanarak radiolabeling reaksiyonu gerçekleştirmek 5 μL (50 μCi) bir -32P-dCTP , 0.5 μL ExTaq DNA polimeraz (5 U/μL) ve H2O. Çalıştır aşağıdaki programı radiolabeling için 50 μL için son ses seviyesini: 94 ° C 5 dakika; 94 ° C 25 döngüleri için 1 dakika, 55 ° C 30 s, 72 ° C için 1 dk; 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bir G-25 spin sütun unincorporated radyoaktif etiketi kaldırmak için kullanın. Radiolabeled örnek eklemeden önce 1dk 720 x g ve MemberForm'un arabellek adlı için sütun pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Radiolabeled reaksiyon ürünü ve etiketli sonda elute 720 x g de 2 dk santrifüj yük.</li>
		<li>Hibridizasyon hemen önce sonda denatüre 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya. Serin kısa bir süre buz.</li>
	</ol></li>
	<li>Güney hibridizasyon<ol>
<li>Islak membran hibridizasyon tüp içine rulo ve taze hazırlanmış hibridizasyon arabellek 25 mL ekleyin: 0,5 M sodyum fosfat tampon, pH 7.2, % 7 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), %1 sığır serum albumin (BSA). 65 ° c 1-2 h döndürme hibridizasyon fırında için kuluçkaya.</li>
		<li>Dikkatle solüsyonu dökün ve hibridizasyon arabellek artı radiolabelled sonda 25 mL ekleyin. 16-18 h döndürme için 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Çözüm bir radyoaktif atık konteyner içine dökün. 5 dk her olarak fosfat-SDS yıkama çözüm ı: 40 mM sodyum fosfat tampon, pH 7.2, oda sıcaklığında 5 yıkama gerçekleştirmek %5 SDS, % 0.5 BSA, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>15 dk her fosfat-SDS yıkama çözüm II ile 65 ° C'de 2 yıkama gerçekleştirmek: 40 mM sodyum fosfat tampon, pH 7.2, % 1 SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Membran Cımbız kullanarak hibridizasyon tüpünden çıkarın ve bir açılan plastik kol koruyucusu yerleştirin. Kapak ve bir görüntüleme plakasına bulaşmasına neden. 4 h 4 d arasında değişen kez farklı pozlama bir dizi deneyin.</li>
		<li>Gerekirse, şerit ve yaklaşık 3 - 4 kez farklı bir sonda kullanarak leke yeniden sonda. Şerit için 2 h 65 ° c 25 ml % 50 formamide, 2 x SSPE çözüm için membran kuluçkaya. Not: 20 x SSPE hisse senedi çözüm: 3 M NaCl, 0.2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7.4.</li>
		<li>Çözüm bir radyoaktif atık konteyner içine dökün. 15 dk her 65 ° C'de 2 yıkama fosfat-SDS yıkama çözüm II içinde gerçekleştirin.</li>
		<li>Bir Gayger sayacı ile membran kontrol ve sinyal kalırsa sıyırma Protokolü tekrarlayın.</li>
		<li>Öncesi hibridizasyon ve hibridizasyon yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ölçme mutasyon oranı ve özgüllük S. cerevisiae suşları
<ol><li>Hücre kültürü hazırlamak<ol>
<li>YPD agar 5 mL 250 mg/mL adenin (adenin takviyesi sadece gerekli ise takıma YPDA suyu içine 100 mg/mL adenin ile desteklenmiş olarak yetiştirilen bir koloni (sağlıklı Maya hücreleri alır 2-3 gün 30 ° c ile formu uygun boyutlu kolonileri) aşılamak kullanılan yük olduğunu bir adenin auxotroph). Doygunluk (36-48 h ciddi büyüme kusur olmadan büyük bir yük için) kültür ulaşıncaya kadar bir shaker kuluçka veya bir rotator 30 ° C üzerinde büyür.</li>
		<li>Spin aşağı hücreleri ~ 2000 x g 5 min için de.</li>
		<li>Süpernatant atın ve hücreleri 5 mL steril su ile yıkayın.</li>
		<li>500 mL steril su hücrelerde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seyreltme hücre kültür ve kaplama<ol>
<li>Sigara seçim denetimleri için 96-şey plaka hücrelerde 1.600.000 ve plaka her kültür tam (COM) plaka üzerine 100 mL faktör tarafından oranında seyreltin.</li>
		<li>Ura3 mutantlar için seçmek için bir vahşi-tipi (WT) yük için 5-FOA levha üzerine su katılmamış hücrelerinin 100 mL plaka. Mutasyon oranı faiz baskı bir WT yük daha yüksek olması bekleniyor Eğer hücreleri buna göre oranında seyreltin.</li>
		<li>Can1 mutantlar için seçmek için hücreleri 5-fold sulandırmak ve canavanine içeren için bir tabak (CAN) bir WT yük üzerine 100 mL plakası. 0,5 seyreltme faktörüdür.</li>
		<li>30 ° C'de tabak mantar kolonileri formu kadar kuluçkaya. Suşları bir büyüme kusur olmadan için 2-3 gün COM için genellikle yeterli olur ve plakaları ve 3-5 gün 5-FOA plakaları için olabilir. Mutasyon oranları farklı suşları arasında karşılaştırmak için aynı gün büyüme kolonileri saymak için seçmek en iyisidir. Soğuk Oda (~ 4 ° C) sayılacak hazır plakaları saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spontan mutasyon oranı hesaplama<ol>
<li>Her plaka üzerinde görünür kolonileri saymak ve koloni sayıların notlar almak</li>
		<li>Drake'in formülü kullanarak mutasyon oranı hesaplamak: μ = f ÷ ln (μNt). f son kültür hücre sayısı bölü mutantlar sayısına göre hesaplanan mutasyon sıklığıdır. NT son kültür hücre sayısı ve μ mutasyon oranı. Bu denklem Newton-Raphson yöntemi gibi yinelemeli bir yöntem tarafından çözülebilir. Mutasyon oranı15hesaplamak için Lea ve Coulson testi de dahil olmak üzere diğer Tahmincisi yöntemleri de vardır.</li>
		<li>Güven aralığı varsayarak günlük normal dağılım bireysel yalıtır utation oranları hesaplamak. % 95 güven aralığı en sık kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mutasyon spektrum analizi<ol>
<li>Plaka veya bir koloni her 5 FOA üzerinden almak ve yenileme YPDA tabağa.</li>
		<li>Koloni URA3 veya CAN1 gen ve sıralaması aşağıdaki primerler kullanılarak mutasyonlar algılamak için yükseltmek için PCR gerçekleştirmek: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') ve URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') için her iki PCR güçlendirme ve 800 bp URA3 gen sıralama; Can1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') ve CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') amplifikasyon ve CAN1-AR için (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') ve CAN1-BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') 1800 bp CAN1 muhabir gen sıralama için.</li>
		<li>Koloni PCR gerçekleştirmek için bir koloni içinde 5 μL H2O resuspend ve 1 μL şablon olarak kullanın. Eklemek her birinin astar (5 mikron hisse senedi) 5 x KAPA2G arabelleği (Mg2 + artı) 2 μL 1 μL, 0.5 μL dNTP (2.5 mM), 0,5 μL, KAPA2G hızlı DNA polimeraz, H2o 12 μL</li>
		<li>URA3 gen amplifikasyon için aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 5 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 30 72 ° C s; 35 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 30 72 ° C s; 2 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C CAN1 gen amplifikasyon için aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 5 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 45 72 ° C s; 35 devredir 10 95 ° c s, 15 61 ° C s, 45 72 ° C s; 2 dk ve tutun 4 ° C'de 72 ° C</li>
		<li>Mutasyonlar tanımlamak için DNASTAR Seqman Pro veya Sequencher gibi bir program kullanarak bir başvuru sırası sıralama sonuçları hizalayın.</li>
		<li>Mutasyon türü (Şekil 4) veya mutasyon konumu (Şekil 5) göre mutasyonlar veri derlemek. (Gözlenen olayları sıralı mutantlar numarasına göre bölünmüş) bir mutasyon sıklığına göre belirli mutasyon oranları genel mutasyon oranı ile çarpımı hesaplayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair.">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li><li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+RNA+Degradation+by+Specific+Base+Catalysis+of+Transesterification+Involving+the+2'-Hydroxyl+Group.">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA.">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li><li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+in+DNA:+origins,+repair+and+consequences.">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication.">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).</li><li>Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luria-Delbruck+fluctuation+experiments:+design+and+analysis.">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved.">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors.">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA.">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li><li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation.">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific.">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li><li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, DNA ikileşmesi ve düzeltilmemiş ribonucleotides mutajenik etkileri sırasında dahil ribonucleotides yarı kantitatif analiz için sık sık kullanılır deneyler iki kümesi protokollerde açıklayın. Bu yaklaşımlar modeli ökaryot S. cerevisiaeiçeren rağmen bu teknikleri diğer mikroplar ve daha yüksek Ökaryotlar kolayca adapte edilebilir.
DNA'daki özel alkalin Elektroforez Southern Blot ile birleştiğinde kullanarak düzeltilmemiş ribonucleotides için yoklama ...

Ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında ribonucleotides tüm üç büyük DNA replicases, DNA polimerazlar (siyaset bilimi) α, ε ve δ1,2tarafından genom dahil edilmiştir. RNase H2-bağımlı ribonucleotide eksizyon tamir (RER3) Bu katıştırılmış ribonucleotides çoğunluğu kaldırır.
2' hidroksil grubu şeker yan 2' - 3' döngüsel fosfat ve diğer 5'-OH4ile bir ucu serbest bitişik fosfodiester bağı saldırabilir gibi DNA'ribonucleotide hidroliz için açıktır. Alkali koşullar büyük ölçüde bu reaksiyon hızlandırabilir. Böylece, temel bir çözümde kuluçka sırasında katıştırılmış ribonucleotides hidroliz özel alkalin Elektroforez5tarafından görüntülenmiştir genomik DNA'ın parçalanma neden olur. Bu DNA'yı bir membran transfer ve doğmakta olan lider - veya ahşap kaplama-strand içine DNA dahil ribonucleotides neden alkali duyarlı sitelerin kimlik izin strand özgü probları Southern blot Analizi tarafından probed, anılan sıraya göre.
Ne zaman topoizomeraz ı (Top1) katıştırılmış ribonucleotide6,7' de DNA nicks RNase H2 etkinlik eksik Maya hücrelerinde ribonucleotides kaldırılması başlatılabilir. Top1 3' tarafında ribonucleotide cleaves, ancak, bu 5'-OH ve religation için ateşe dayanıklı 2' - 3' döngüsel fosfat DNA uçları oluşturur. Hata onarım veya bu 'kirli biter' anormal işlenmesi için genomik istikrarsızlık neden olabilir. Ayrıca, tekrar bir DNA dizisi içinde belgili tanımlık kesme ortaya çıkarsa, onarma işleminin silme mutasyonlar için yol açabilir. Bu özellikle sorunlu tandem tekrarlar için olduğunu, nerede silme işlemlerini kısa (, beş ve iki baz çifti arasındaki) RNase H2-eksik hücrelerinde yaygın olarak gözlenmektedir. Top1 bağımlı zararlı etkileri Maya RNase etkinlik şiddetlenir DNA polimeraz ε mutant (pol2-M644G) ribonucleotide birleşme sırasında doğmakta olan önde gelen strand sentezi için karışık içinde H2 yokluğunda.
DNA'ribonucleotides işlenmesi için spontan mutasyonlar neden olur ve bu mutagenesis uygun reporter genler kullanarak ve beraberindeki fenotipik değişiklik için seçildiğinde tespit edilebilir. Bir dalgalanma test veya Luria ve Delbrück deney seçilebilir reporter genler8,9kullanarak spontan mutasyon oranları ölçmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Maya, URA3 ve CAN1 genler gen fonksiyon kaybına neden tüm mutasyon tipleri tespiti için sağlar bir ileri mutasyon tahlil gazetecilere olarak kullanılabilir. Spontan mutasyon oranı hedef muhabir gen mutasyonlar olmadan tek kolonilerden başladı birden çok paralel kültürü için gözlenen ortancası olarak tahmin edilmektedir. Bir Maya RNase H2-eksik soy rnh201Δ büyük ölçüde 2-5 bp silme tandem yükseltilmiş bir insidansı neden olur orta derecede yüksek bir genel olarak spontan mutasyon oranı gibi dizileri yineleyin. Böylece, tamamen ribonucleotides genom içinde mutajenik etkileri karakterize için belirli mutasyon oranları tespit gerekir. Bu durumda, URA3 veya CAN1 muhabir genleri güçlendirilmiş ve türleri ve mutasyonlar yerlerini belirlemek için sıralı ve belirli mutasyon oranları hesaplanabilir. Birden çok bağımsız URA3 veya CAN1 mutantlar tanımlanan mutasyonlar derleme daha sonra bir mutasyon spektrum oluşturmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>YPD media</td><td></td><td></td><td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td></tr><tr><td>COM plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &amp;ndash; 35 ml per plate.</td></tr><tr><td>CAN plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 56 &amp;deg;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td></tr><tr><td>5-FOA plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 60 &amp;deg;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td></tr><tr><td>L-Canavanine sulfate</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL glass culture tube</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Culture rotator in 30 &amp;deg;C incubator</td><td></td><td></td><td>Shaker incubator can be used instead</td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td></td><td></td><td>Sterile, any brand</td></tr><tr><td>3 mm glass beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>12-channel pipettes</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polymerase</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Newer model available</td></tr><tr><td>dsDNA BR Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSF10400</td><td></td></tr><tr><td>Bromocresol green</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>UV transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Chromotography paper</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 spin column</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9638);&lt;br/&gt; Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

Genomik istikrarsızlık kaynağı olmaya ribonucleotides nükleer DNA'varlığı gösterilmiştir. Ribonucleotide birleşme ölçüde alkali hidroliz tarafından tespit edilebilir ve RNA hidroliz alkali koşullarda son derece duyarlı olduğu gibi Elektroforez jel. Bu, Southern blot analizi ile birlikte yerini belirlemek ve ribonucleotides dahil var haline hangi strand için kullanılabilir. Ancak, bu yordam yalnızca yarı nicel ve strand özgü Southern blot sondalama hassasiyeti artırır, ancak ribonucleotide içeriğinde, küçük değişiklikleri algılamak için duyarlı olmayabilir. En çarpıcı biyolojik sonuçlarından biri DNA'ribonucleotides ölçüsü olarak, kendiliğinden mutagenesis bir ileri mutasyon tahlil kullanılarak analiz edilebilir. Uygun reporter genler kullanarak, işlev kaybına neden olur nadir mutasyonlar seçili ve genel olabilir ve muhabir gen DNA sıralama ile dalgalanma deney verileri birleştirerek belirli mutasyon oranları ölçülebilir. Dalgalanma tahlil çok çeşitli mutajenik işlemlerinde belirli genetik arka plan veya büyüme koşulları incelemek için geçerlidir.

Tedavi ile alkali jel elektroforez tarafından takip alkali genomik DNA'ın DNA fragmantasyonu stabil anonim ribonucleotides çokluğu nedeniyle yarı kantitatif algılanması için izin verir. Şekil 2 genomik DNA veya KOH5olmadan tedavi Maya jel görüntüleri gösterir. Pol2, Polε, katalitik alt M644L türevi M644G mutant WT polimeraz daha daha fazla ribonucleotides içerir iken ribonucleotides dahil yeteneği azalttı. İletişim ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis at Jo

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K Görüntüleme.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Video: Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Biyokimya

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetik

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Kanser Araştırmaları

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biyoloji

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Gelişim Biyolojisi

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler