Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

Maya hücrelerinin 1. Büyüme <ol><li> MRNA bozulma oranı ölçümleri için kullanılacak uygun maya suşları seçin. RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe etmek için, rpb1-1 mutasyon 1 barındıran maya suşları kullanılır. Zaten var laboratuar bu maya suşu elde edilir, ya da belirli bir genetik arka 9 gerekli ise, standart teknikler kullanılarak laboratuarda üretecektir. </li><li> Standart prosedürler kullanılarak 10 maya ortamı hazırlamak, steril tekniği kullanarak. Hiçbir seçim gerekiyorsa, örneğin YPD gibi zengin medya hazırlamak. Plasmidler ve seçimi ile transforme edilmiş maya hücreleri gerekli ise, alternatif olarak, seçici ortam hazırlar. Medya otoklavlayın. </li><li> Bu maya suşu için müsamahakar sıcaklık 28 ° C&#39;de maya hücreleri büyütün. İki adımda yapın: <ol><li> İlk olarak O / N için, doyma noktasına kadar büyüme ortamı 5 ml maya hücreleri büyür.</li><li> İkinci günün sonunda ikinci O / N ayarlayın. Ikinci O / N, ilk olarak O / N, 100 ul 1 mi, 2 ml veya daha fazlasına kadar değişen büyüme ortamı (100-150 ml maya hücrelerinin farklı miktarlarda inoküle bağlı olarak maya hücreleri gerektiğinde ) ertesi gün toplandı. Kültürlerinden biri doğru OD 600 Ertesi gün olmasını sağlamak için bu adımı yapın. </li></ol></li></ol> 2. Hasat Maya Hücreleri <ol><li> Maya hücreleri hasat hazırlayın. Bu aşama için zamanlama önemlidir; Gerekli tüm tüpleri etiket ve tek bir yerde tüm gerekli ekipman ve malzemeleri toplamak. 39 ° C bir su banyosu önceden ısıtmak ve C 28 ° C &#39;de ve 60 ° C&#39;de büyüme ortamı içinde iki adet 15 ml&#39;lik deney tüpleri ısıtın. NOT: 15 mi büyüme ortamı hacmi hücreleri hasat edilecek zaman noktalarının sayısına bağlı olarak değişebilir. </li><li> Onlar 0,7 bir OD 0.4 600 ulaştığınızda maya hücreleri Hasat. Transfer 4 hücreler - 50 6 steril ml kap şişe vida. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yüksek hızlı santrifüj içinde 7500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant atılır ve 28 ° C&#39;de dengeye 15 mi büyüme ortamı içinde pelet tekrar süspansiyon. Bir steril 250 ml&#39;lik bir şişe içinde maya hücreleri havuzda toplayın ve 28 ° C artış sıcaklıkta ~ 5 dakika boyunca, onları dengeye getirin. </li><li> Maya hücreleri büyüme sıcaklığında dengeye ulaştıktan hemen sonra, 39 ° C (infeksiyona izin vermeyen sıcaklık) kadar ısısını yükseltmek için 60 ° C &#39;de dengelenmiş bir büyüme ortamı 15 ml ilave edilir ve hemen 39 ° C su banyosu içine yerleştirilir . Kültür ortamı, transkripsiyon kapalı olduğundan emin olmak için, kalan hücre hasat etme aşamalarının boyunca 39 ° C su banyosu içinde kalmasını sağlayın. </li><li> 39 ° C su banyosu içinde bir balon yerleştirdikten sonra farklı zamanlarda hücreler hasat edilir. İlk kez noktası için, 39 &amp; # de balon yerleştirdikten sonra hemen hücreler hasat176 ° C. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir 3 ml&#39;lik bir şişe Hasat ve ikiye 3 ml dağıtın. Mini santrifüj içinde 10 saniye boyunca pelet hücreleri veya hızlı yavaşlama ile picofuge ve süpernatant dışarı dökün. </li><li> Hemen bir kuru buz / etanol banyosu içinde veya sıvı azot içinde dondurularak pelet. Hücreler sıfır zaman noktası olarak hasat ilk kez noktasını belirleyin. </li><li> Deneysel olarak ilgi mRNA bağlı olarak, bir pilot deneyi ile hücreler daha sonra hasat edilmiş zaman noktaları belirlenir. Normal olarak, aşağıdaki zaman noktalarında, hasat maya hücreleri: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 ve 35 dakika (Şekil 2B). MRNA yarılanma ömrü yukarıda belirtilen zaman noktalarını kullanarak tespit edilemiyorsa, bu sefer noktaları ayarlayın. Örneğin, beklenen kısa yarı ömürlü mRNA için, daha kısa süreler noktaları kullanarak (örneğin, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 ve 18 dakika) ve beklenen uzun yarı ömürleri olan mRNA için genişletmek zaman noktalarında. </li><li> Sonra hücreler, hektar olanRNA ekstraksiyon yapılır kadar rvested, -80 ° C derin dondurucuda saklayın. </li></ol> Maya Hücreleri 3. Özü RNA <ol><li> Protokol RNA ekstraksiyon kısmı için, RNaslar göre RNA bozulmasını önlemek için RNazsız tekniklerini kullanır. RNazsız çözümler, cam ve plastik eşya RNA ekstraksiyon kullanılacak hazırlayın. </li><li> , Standart protokollere göre, maya hücrelerinden RNA ekstrakte edin. Tipik haliyle, sıcak fenol metodu 12 kullanımı. Seçenek olarak ise, maya hücrelerinden RNA çıkarmak için kullanılabilir setleri kullanın. </li><li> Normal olarak bir 260 emicilik ve Nanodrop kullanılarak RNA&#39;nın bir 280 2 ul ölçülerek, RNA miktarı ve saflık belirler. Konsantrasyonuna göre bir 260 RNA konsantrasyonu belirlemek, 1 ug RNA seyreltik / DEPC işlenmiş su ile ul. NOT: Bir 260 oranı / t hakkında bilgi sağlayan bir 280RNA o saflık. A 260 / A 280 oranı 2.0 ± 0.1 ise bir RNA örneği saf. </li></ol> 4. Northern Blot analizi NOT: mRNA düzeylerini ölçmek ve transkript boyutu hakkında bilgi almak için kuzeydeki lekeleri kullanın. Buna ek olarak, aynı mRNA&#39;nın çok izoformlar üretmek mRNA&#39;ların saptamak için northern blot kullanır. <ol><li> % 1.0 agaroz-formaldehid jel hazırlayın. Standart protokollere göre 12 elektroforez ile agaroz formaldehit jel üzerinde örnek RNA eşit miktarda çalıştırın. RNA örnekleri yanında bir RNA merdiveni çalıştırın ve kuzey leke tespit edilir RNA boyutlarını belirlemek için kullanabilirsiniz. Bir zar agaroz formaldehit jel üzerinde ayrılmış RNA aktarmadan önce, jel RNA merdiveni ile sokağın kesti ve etidyum bromür kullanarak görselleştirmek. NOT: Alternatif olarak, tüm jel RNA transferinden önce etidyum bromür ile boyanmış olabilir. </li><li> Birfter RNA numuneleri jel üzerinde uygun bir mesafede göç etti RNazsız teknikler kullanılarak bir zara RNA aktarın. Membranların 12-13 kadar RNA aktarmak için kullanılabilecek birkaç protokollerden birini kullanın. Bir membrana transfer etmek için RNA, jel ile yaklaşık olarak aynı boyuta membran kesti. Standart protokollere göre 12 RNA aktarın. </li><li> UV üreticisinin yönergeleri izleyerek UV çapraz bağlayıcı kullanılarak membran RNA çapraz bağlantı. Seçenek olarak ise, 1 saat boyunca 80 ° C&#39;ye ayarlanmış bir fırın içinde membran fırında. Belirli problara hibridize edilir kadar belirsiz bir süre, bir plastik torba içinde -20 ° C de membran saklayın. NOT: Kuru zar da filtre kağıtları arasında oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> 5. melezleşen Problar Membran İlgi RNA Tamamlayıcı NOT: zar üzerinde mRNA&#39;yı tespit etmek için bir yol 32P olarak etiketlenmiş DNA sondaları hibridize etmektir. DİKKAT: Resea32 P ile çalışan rchers kontaminasyonu önlemek için koruyucu prosedürleri kullanmak gerekir. Radyoaktif madde kullanımı ile ilgili kurumsal kurallara uyun. <ol><li> 25 etiketleme DNA probu hazırlayın - DNA 50 ng standart protokollere göre 12 zara hibridize edilecek. PCR ya da plazmid sindirme ile DNA fragmanını üretir. Adi nükleotidleri 12 çıkarıldıktan sonra radyo-etiketli DNA probu 1 ul sayılarak DNA probu spesifik aktivitesini belirler. </li><li> 42 ° C&#39;de ön ısıtma ön hibridizasyon / hibridizasyon tamponu. Membran 12, 100 cm2 başına ön hibridizasyon / hibritleme tampon maddesi ile 10 mL kullanın. </li><li> 1 melezleşme - membran O hibridizasyon tampon ml&#39;si başına, radyo-etiketli bir DNA probu, 5 x 10 6 cpm /, bir hibridizasyon etüvü içinde bir N ilgi 12 mRNA&#39;yı tespit etmek için. Melezleme sırasında hibridizasyon fırın dönme bir yönde olduğundan emin olun kitüm membran uygun hibridizasyon sağlamak için, hibridizasyon çözeltisine maruz neden olur. </li><li> 2x SSPE, 50 ml ve 15 dakika 12 2x SSPE /% 2 SDS, 50 ml 65 ° C de bir kez 15 dakika için oda sıcaklığında, membran iki kez yıkayın. O kurumasına veya Fosfor ekranı kontamine olmadığından emin olmak için plastik wrap membran sarın. </li><li> Bir Geiger sayacı kullanarak, membran üzerindeki radyoaktivite yoğunluğunu tahmin ediyoruz. NOT: Bu tahmin membran zaman uygun miktarda fosfor ekranına maruz kalmasını sağlar. Radyoaktivite düşük miktarlarda zarlar daha uzun maruz bırakma sürelerinin kullanılması. </li><li> Kuzey lekeleri için, RNA eşit miktarlarda her yerinde yüklenen onaylamak için bir yükleme denetimi kullanın. Bunu yapmak için, membran şerit ve işlem incelenen etkilenmez bir RNA ile yeniden taranması. XS sökme çözeltisi (% 0.1 SDS / 0.01 kaynayan 200 ml ihtiva eden bir cam tepsi üzerine yerleştirerek, membran şerit2 dakika boyunca SC). Sıyırma çözüm dökün ve prosedür beş kez tekrarlayın 12. NOT:. Bir yükleme kontrolü olarak kullanılan bir RNA örneği SCR1 olan SCR1 istikrarlı ve bol bir RNA polimeraz III transkript olan SCR1 RNA bereket RNA polimeraz II inhibisyonu kısa dönemlerde önemli bir değişiklik olmamalıdır.. </li></ol> 6. Membran Bound olan RNA niceliğini NOT: zar üzerindeki radyoaktivite miktarını ölçmek bir fosfor ekranına membran göstermek için. Uygun pozlama süresinden sonra, bir fosforimager kullanılarak Fosfor ekranını tarayın. <ol><li> Phosphorimager üreticisi tarafından sağlanan talimatları kullanarak Fosfor ekranını tarayın. </li><li> Her bir zaman noktasında mRNA ölçmek. ImageQuant yazılım veya ilgili yazılım kullanarak mRNA düzeylerini ölçmek. Yükleme kontrolü için her bir zaman noktasında mRNA normalize edilir. SCR1 yükleme olarak kullanılmışsaKontrol, SCR1 için yarılanma ömrü Northerns normalleştirmek. </li><li> mRNA bir yarılanma ömrü alanına 0 mRNA mevcut miktarıyla her zaman noktasında kalan mRNA miktarını (ilk zaman noktası) bölünmesi ile hesaplanır. Semilogaritmik arsa (Şekil 2C) üzerine, zamana karşı olarak kalan mRNA grafik. Aşağıdaki denklem ile mRNA yarı ömürleri hesaplayın: t 1/2 = -0,693 / k (negatif 0.693) </li><li> k en uygun doğrunun eğimi ve t 1/2 mRNA yarı-ömrü. </li></ol>

<ol>
	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+thiolutin,+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .</li><li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors.">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li><li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li><li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast.">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li><li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMD:+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination.">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li><li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Polymerase+II+subunit+composition,+stoichiometry+and+phosphorylation.">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).</li><li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics).">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li><li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

MRNA sentezinin ve yeni sentez yokluğunda mRNA değişmesi takip durdurulması sıklıkla mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. S. cerevisiae RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe mRNA bozunma oranları ölçümü en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntem, özellikle, RNA polimeraz II inhibe eder. Bu tekniği kullanarak, mRNA bozulma oranlarının belirlenmesi için en kritik adımlar şunlardır: 1) maya hücreleri hasat önce, bu tr...

transkripsiyon ve spesifik mRNA bozunma gen ekspresyonunun önemli belirleyicilerdir. sentez ve özel mRNA&#39;ların çürüme oranı o mRNA kararlı durum seviyesini belirler. mRNA&#39;lann kararlı durum düzeyleri mRNA bereket yöneten ve protein sentezi için ne kadar her mRNA belirler. MRNA yarı hayatımızın Ölçümler mRNA çürüme hızını belirlemek için yoğun olarak kullanılmaktadır. MRNA, mRNA ve çevre koşulları ile kodlanan proteinin fonksiyon özellikleri ile ilgili farklı oranlarda özel mRNA&#39;lar bozunma. MRNA bozulma oranlarını belirlemek için kullanılan tekniğe bağlı olarak, çürüme hızı ölçümleri ya küresel ya da bireysel transkript için tespit edilebilir. Maya S. olarak cerevisiae, yaygın genel mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan teknikler, RNA polimeraz II ve kimyasal transkripsivonel sıcaklığa duyarlı allel barındıran bir maya suşu kullanılarak içerirBu tür thiolutin ve 1,10-fenantrolin 1-5 gibi riptional inhibitörleri yer alır. Bu yöntemler ferdi mRNA bozunma hızını 4 ölçmek için kullanılabilir. Diğer yöntemler, ayrıca, mRNA&#39;nın bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemler, kararlı durum etiketleme veya yalnızca belirli koşullarda eksprese edilen bir düzenlenmiş arttırıcının eksprese edilen mRNA moleküllerinin kullanımına yolla uygulanabilir. Bu tekniklerin her biri belirli avantajlara ve sınırlamalar vardır. Burada anlatılan teknik, RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel kullanmaktadır. Bu yöntem, S. kullanır cerevisiae modeli olarak, spesifik transkripsiyon inhibisyon teknikleri 6 kullanan diğer sistemlerde değiştirilmiş ve kullanılmıştır ama. RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile mRNA yarı ömrü ölçümleri kapsamlı mRNA bozulma 4-5 iki genom ve tek tek ölçümler için kullanılmıştır. Bu teknik, bir Belir kullanımını gerektirirRNA polimeraz II, rpb1-1 1 &#39;in bir sıcaklığa duyarlı allel barındırır ic maya suşu. Bu teknik için mantık infeksiyona izin vermeyen sıcaklık sıcaklığa duyarlı maya soyunun maruz mRNA sentezini inhibe olmasıdır. Transkripsiyon inhibe sonra Daha sonra, önceden mevcut olan mRNA çürüme farklı zaman noktalarında izlenir. önceden var olan mRNA kaybolması transkripsiyon kapatıldıktan sonra farklı zaman noktalarında, maya hücrelerinden RNA ekstre ederek izlenir. maya hücreleri hasat olduğu zaman noktaları pilot deney tarafından önceden belirlenmiş ve transkript ve sistem araştırılıyor bağlıdır edilmektedir. Daha uzun bir zaman noktaları uzun yaşayan transkript için kullanılır ise daha hızlı zaman noktalarında, kısa ömürlü transkript için kullanılır. Daha sonra, mRNA&#39;nın çürüme ya da Kuzey benek analizi, kantitatif PCR ya da RNAseq ile izlenir. Bir te kullanarak mRNA yarı ömürleri ÖlçümüRNA polimeraz II mperature duyarlı allel avantajları vardır. Öncelikle, bu teknik yalındır kolay ve. İkinci olarak, maya cinsi, mRNA, yarı ömrü ölçümleri değişik büyüme koşulları belirlenebilir laboratuarda elde edilen veya oluşturulan bir kez; mRNA çürüme çevre etkisinin belirlenmesi sağlayan. Üçüncü olarak, mRNA, bozunma oranları genom izlenebilir. Diğer transkripsiyon önleme tekniklerinin kullanımı da avantajları ve sınırlamaları vardır. Örneğin, bir uyarılabilir promoterin kullanılması düzenlenmiş bir arttırıcının kontrolü altında olan bir mRNA üretmek üzere subklonlama gerektirir. Thiolutin hazır değil ve zaman pahalı kullanılabilir. Ayrıca, eylem thiolutin en modu tam olarak anlaşılamamış ve mRNA çürüme 7 inhibe dahil olmak üzere diğer hücresel süreçleri etkilediği bildirilmiştir. Seçenek olarak ise, 1,10-fenantrolin, daha kolaylıkla temin edilebilir. Bundan başka, tüm teknikler pert olabilir transkripsiyonunu inhibe etmek için kullanılırHücresel fonksiyonu URB ve farklı şekillerde farklı mRNA&#39;ları etkileyebilir. Bir araştırmacı, en güvenilir sonuçlar elde etmek için deneysel koşullarda kullanmak için en uygun yöntemi belirlemek gerekiyor. Uygulama için en uygun olan yöntem belirlemek için, bir araştırmacı araştırılmaktadır transkript tarafından kodlanan proteinlerin transkript ve işlevini tanımlamak gerekiyor. en güvenilir mRNA çürüme oranı ölçümleri birden teknikler kullanılarak ve aynı çürüme oranı gösteriyor belirlenir olanlardır. Tek bir tekniktir her zaman en iyi ve en uygun tekniği özel duruma bağlıdır. S. sayısız çalışma cerevisiae çeşitli koşullarda ve genetik geçmişleri mRNA çürüme oranları ölçüldü. mRNA çürüme oranları ölçülür olduğu koşulların belirli deney araştırılıyor bağlıdır. Koşullar olmanın olsun farklı hücresel ortamlarda mRNA bozulma oranlarını Ölçme belirlertercihen özel mRNA bozulma oranlarını etkileyen incelenir. mRNA çürüme oranları da kullanılan maya suşu bağlı olarak değişebilir. Örneğin mRNA, bozunma oranları işlevsiz bir saçma kaynaklı mRNA azalma (NMD) yolu ile yabani tip maya hücreleri ve maya hücreleri belirlenebilir. Bu mRNA bozulması yolu şimdiye kadar incelenmiş tüm ökaryot organizmalarda bulunan ve erken çeviri 8 sonlandırmak mRNAların bozulmasını tetikler. NMD başlangıçta erken sonlandırma edilen ya da anlamsız kodonlanyla mRNA&#39;ları düşürür bir yol olarak tespit edilmiştir, ama şimdi de doğal mRNA&#39;ları içermeyen saçmalık ifadesini düzenleyen bir yol olarak kabul edilmektedir. yolunun hedefleri mRNA&#39;lar hızla fonksiyonel NMD yolu ile maya hücrelerinde parçalanır ve fonksiyonel olmayan NMD yolu ile maya hücrelerinde stabilize edilir. Bu nedenle, bu yolağın doğrudan hedefleri olan mRNA yarı-ömürleri, yabani tip maya cel daha kısadır veBir fonksiyonel olmayan NMD yolu ile, maya hücreleri ile karşılaştırıldığında mi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:479px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Speed Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Genescreen Plus membrane</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>50-905-0169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hybridization Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>95-0030-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphor screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon phosphorimager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29004080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV cross-linker</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>80-6222-31</td>
			<td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&#176; for 1 hour</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:272px;">NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM8677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA kararlı durum düzeyleri çevresel koşullara bağlı olarak değişir. Bir mRNA&#39;nın kararlı durum birikimi seviyelerinin düzenlenmesi proteinin doğru miktarı, hücrenin özel büyüme koşulları için sentez edilmesini sağlar. MRNA bozulma oranlarını ölçmek için bir yaklaşım transkripsiyonu inhibe ve daha sonra zaten mevcut mRNA kaybolması izleme olduğunu. mRNA azalma oranını daha sonra tayin edilebilir ve doğru bir yarı ömür çeşitli teknikler kullanılarak tespit edilebilir. S. cerevisiae yarı ömürleri geliştirilmiştir mRNA ölçmek ve RNA polimeraz II, rpb1-1 bir sıcaklığa duyarlı allel liman suşları kullanılarak mRNA&#39;nın transkripsiyonunu inhibe içerir protokolleri. Bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında kodlayan mRNA kullanılarak yarı ömürleri gibi alternatif thiolutin veya 1,10-fenantrolin gibi veya kopyalama önleyicileri ile transkripsiyonu inhibe içerir mRNA ölçmek için diğer teknikler,Bu tür galaktoz ile uyarılabilir promoteri ve TET off sistemi. Burada, biz S. ölçümü tanımlamak RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile cerevisiae mRNA bozunma oranları. Bu teknik, tek tek mRNA ya da genom çapında mRNA bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir.

<html> RNA ve kuzey blotting ayıklanması sırasında doğru mRNA bozulma oranlarını ölçmek için bu protokolün yeteneği RNazsız tekniklerin transkripsiyonu inhibe, uygun zaman noktalarında maya hücreleri hasat ve kullanımına bağlıdır. Sırasıyla, stabil olmayan ve kararlı olduğu bilinmektedir iki kontrol mRNA araştırmayı deney çalışan güven sağlar. Örneğin, bu ve mRNA ön CYH2 iki tespit eden bir prob ile tarama gerçekleştirilebilir oluşturulmaktadır. Şekil 2B, ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Belirli mRNA&#39;ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA&#39;nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.4K Görüntüleme.  Baylor University.  Belirli mRNA'ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA'nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor. 

Video: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR kofaktörleridir Redox Titrasyonu İzlenen<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...