Name: measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

Maya hücrelerinin 1. Büyüme <ol><li> MRNA bozulma oranı ölçümleri için kullanılacak uygun maya suşları seçin. RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe etmek için, rpb1-1 mutasyon 1 barındıran maya suşları kullanılır. Zaten var laboratuar bu maya suşu elde edilir, ya da belirli bir genetik arka 9 gerekli ise, standart teknikler kullanılarak laboratuarda üretecektir. </li><li> Standart prosedürler kullanılarak 10 maya ortamı hazırlamak, steril tekniği kullanarak. Hiçbir seçim gerekiyorsa, örneğin YPD gibi zengin medya hazırlamak. Plasmidler ve seçimi ile transforme edilmiş maya hücreleri gerekli ise, alternatif olarak, seçici ortam hazırlar. Medya otoklavlayın. </li><li> Bu maya suşu için müsamahakar sıcaklık 28 ° C&#39;de maya hücreleri büyütün. İki adımda yapın: <ol><li> İlk olarak O / N için, doyma noktasına kadar büyüme ortamı 5 ml maya hücreleri büyür.</li><li> İkinci günün sonunda ikinci O / N ayarlayın. Ikinci O / N, ilk olarak O / N, 100 ul 1 mi, 2 ml veya daha fazlasına kadar değişen büyüme ortamı (100-150 ml maya hücrelerinin farklı miktarlarda inoküle bağlı olarak maya hücreleri gerektiğinde ) ertesi gün toplandı. Kültürlerinden biri doğru OD 600 Ertesi gün olmasını sağlamak için bu adımı yapın. </li></ol></li></ol> 2. Hasat Maya Hücreleri <ol><li> Maya hücreleri hasat hazırlayın. Bu aşama için zamanlama önemlidir; Gerekli tüm tüpleri etiket ve tek bir yerde tüm gerekli ekipman ve malzemeleri toplamak. 39 ° C bir su banyosu önceden ısıtmak ve C 28 ° C &#39;de ve 60 ° C&#39;de büyüme ortamı içinde iki adet 15 ml&#39;lik deney tüpleri ısıtın. NOT: 15 mi büyüme ortamı hacmi hücreleri hasat edilecek zaman noktalarının sayısına bağlı olarak değişebilir. </li><li> Onlar 0,7 bir OD 0.4 600 ulaştığınızda maya hücreleri Hasat. Transfer 4 hücreler - 50 6 steril ml kap şişe vida. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yüksek hızlı santrifüj içinde 7500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant atılır ve 28 ° C&#39;de dengeye 15 mi büyüme ortamı içinde pelet tekrar süspansiyon. Bir steril 250 ml&#39;lik bir şişe içinde maya hücreleri havuzda toplayın ve 28 ° C artış sıcaklıkta ~ 5 dakika boyunca, onları dengeye getirin. </li><li> Maya hücreleri büyüme sıcaklığında dengeye ulaştıktan hemen sonra, 39 ° C (infeksiyona izin vermeyen sıcaklık) kadar ısısını yükseltmek için 60 ° C &#39;de dengelenmiş bir büyüme ortamı 15 ml ilave edilir ve hemen 39 ° C su banyosu içine yerleştirilir . Kültür ortamı, transkripsiyon kapalı olduğundan emin olmak için, kalan hücre hasat etme aşamalarının boyunca 39 ° C su banyosu içinde kalmasını sağlayın. </li><li> 39 ° C su banyosu içinde bir balon yerleştirdikten sonra farklı zamanlarda hücreler hasat edilir. İlk kez noktası için, 39 &amp; # de balon yerleştirdikten sonra hemen hücreler hasat176 ° C. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir 3 ml&#39;lik bir şişe Hasat ve ikiye 3 ml dağıtın. Mini santrifüj içinde 10 saniye boyunca pelet hücreleri veya hızlı yavaşlama ile picofuge ve süpernatant dışarı dökün. </li><li> Hemen bir kuru buz / etanol banyosu içinde veya sıvı azot içinde dondurularak pelet. Hücreler sıfır zaman noktası olarak hasat ilk kez noktasını belirleyin. </li><li> Deneysel olarak ilgi mRNA bağlı olarak, bir pilot deneyi ile hücreler daha sonra hasat edilmiş zaman noktaları belirlenir. Normal olarak, aşağıdaki zaman noktalarında, hasat maya hücreleri: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 ve 35 dakika (Şekil 2B). MRNA yarılanma ömrü yukarıda belirtilen zaman noktalarını kullanarak tespit edilemiyorsa, bu sefer noktaları ayarlayın. Örneğin, beklenen kısa yarı ömürlü mRNA için, daha kısa süreler noktaları kullanarak (örneğin, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 ve 18 dakika) ve beklenen uzun yarı ömürleri olan mRNA için genişletmek zaman noktalarında. </li><li> Sonra hücreler, hektar olanRNA ekstraksiyon yapılır kadar rvested, -80 ° C derin dondurucuda saklayın. </li></ol> Maya Hücreleri 3. Özü RNA <ol><li> Protokol RNA ekstraksiyon kısmı için, RNaslar göre RNA bozulmasını önlemek için RNazsız tekniklerini kullanır. RNazsız çözümler, cam ve plastik eşya RNA ekstraksiyon kullanılacak hazırlayın. </li><li> , Standart protokollere göre, maya hücrelerinden RNA ekstrakte edin. Tipik haliyle, sıcak fenol metodu 12 kullanımı. Seçenek olarak ise, maya hücrelerinden RNA çıkarmak için kullanılabilir setleri kullanın. </li><li> Normal olarak bir 260 emicilik ve Nanodrop kullanılarak RNA&#39;nın bir 280 2 ul ölçülerek, RNA miktarı ve saflık belirler. Konsantrasyonuna göre bir 260 RNA konsantrasyonu belirlemek, 1 ug RNA seyreltik / DEPC işlenmiş su ile ul. NOT: Bir 260 oranı / t hakkında bilgi sağlayan bir 280RNA o saflık. A 260 / A 280 oranı 2.0 ± 0.1 ise bir RNA örneği saf. </li></ol> 4. Northern Blot analizi NOT: mRNA düzeylerini ölçmek ve transkript boyutu hakkında bilgi almak için kuzeydeki lekeleri kullanın. Buna ek olarak, aynı mRNA&#39;nın çok izoformlar üretmek mRNA&#39;ların saptamak için northern blot kullanır. <ol><li> % 1.0 agaroz-formaldehid jel hazırlayın. Standart protokollere göre 12 elektroforez ile agaroz formaldehit jel üzerinde örnek RNA eşit miktarda çalıştırın. RNA örnekleri yanında bir RNA merdiveni çalıştırın ve kuzey leke tespit edilir RNA boyutlarını belirlemek için kullanabilirsiniz. Bir zar agaroz formaldehit jel üzerinde ayrılmış RNA aktarmadan önce, jel RNA merdiveni ile sokağın kesti ve etidyum bromür kullanarak görselleştirmek. NOT: Alternatif olarak, tüm jel RNA transferinden önce etidyum bromür ile boyanmış olabilir. </li><li> Birfter RNA numuneleri jel üzerinde uygun bir mesafede göç etti RNazsız teknikler kullanılarak bir zara RNA aktarın. Membranların 12-13 kadar RNA aktarmak için kullanılabilecek birkaç protokollerden birini kullanın. Bir membrana transfer etmek için RNA, jel ile yaklaşık olarak aynı boyuta membran kesti. Standart protokollere göre 12 RNA aktarın. </li><li> UV üreticisinin yönergeleri izleyerek UV çapraz bağlayıcı kullanılarak membran RNA çapraz bağlantı. Seçenek olarak ise, 1 saat boyunca 80 ° C&#39;ye ayarlanmış bir fırın içinde membran fırında. Belirli problara hibridize edilir kadar belirsiz bir süre, bir plastik torba içinde -20 ° C de membran saklayın. NOT: Kuru zar da filtre kağıtları arasında oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> 5. melezleşen Problar Membran İlgi RNA Tamamlayıcı NOT: zar üzerinde mRNA&#39;yı tespit etmek için bir yol 32P olarak etiketlenmiş DNA sondaları hibridize etmektir. DİKKAT: Resea32 P ile çalışan rchers kontaminasyonu önlemek için koruyucu prosedürleri kullanmak gerekir. Radyoaktif madde kullanımı ile ilgili kurumsal kurallara uyun. <ol><li> 25 etiketleme DNA probu hazırlayın - DNA 50 ng standart protokollere göre 12 zara hibridize edilecek. PCR ya da plazmid sindirme ile DNA fragmanını üretir. Adi nükleotidleri 12 çıkarıldıktan sonra radyo-etiketli DNA probu 1 ul sayılarak DNA probu spesifik aktivitesini belirler. </li><li> 42 ° C&#39;de ön ısıtma ön hibridizasyon / hibridizasyon tamponu. Membran 12, 100 cm2 başına ön hibridizasyon / hibritleme tampon maddesi ile 10 mL kullanın. </li><li> 1 melezleşme - membran O hibridizasyon tampon ml&#39;si başına, radyo-etiketli bir DNA probu, 5 x 10 6 cpm /, bir hibridizasyon etüvü içinde bir N ilgi 12 mRNA&#39;yı tespit etmek için. Melezleme sırasında hibridizasyon fırın dönme bir yönde olduğundan emin olun kitüm membran uygun hibridizasyon sağlamak için, hibridizasyon çözeltisine maruz neden olur. </li><li> 2x SSPE, 50 ml ve 15 dakika 12 2x SSPE /% 2 SDS, 50 ml 65 ° C de bir kez 15 dakika için oda sıcaklığında, membran iki kez yıkayın. O kurumasına veya Fosfor ekranı kontamine olmadığından emin olmak için plastik wrap membran sarın. </li><li> Bir Geiger sayacı kullanarak, membran üzerindeki radyoaktivite yoğunluğunu tahmin ediyoruz. NOT: Bu tahmin membran zaman uygun miktarda fosfor ekranına maruz kalmasını sağlar. Radyoaktivite düşük miktarlarda zarlar daha uzun maruz bırakma sürelerinin kullanılması. </li><li> Kuzey lekeleri için, RNA eşit miktarlarda her yerinde yüklenen onaylamak için bir yükleme denetimi kullanın. Bunu yapmak için, membran şerit ve işlem incelenen etkilenmez bir RNA ile yeniden taranması. XS sökme çözeltisi (% 0.1 SDS / 0.01 kaynayan 200 ml ihtiva eden bir cam tepsi üzerine yerleştirerek, membran şerit2 dakika boyunca SC). Sıyırma çözüm dökün ve prosedür beş kez tekrarlayın 12. NOT:. Bir yükleme kontrolü olarak kullanılan bir RNA örneği SCR1 olan SCR1 istikrarlı ve bol bir RNA polimeraz III transkript olan SCR1 RNA bereket RNA polimeraz II inhibisyonu kısa dönemlerde önemli bir değişiklik olmamalıdır.. </li></ol> 6. Membran Bound olan RNA niceliğini NOT: zar üzerindeki radyoaktivite miktarını ölçmek bir fosfor ekranına membran göstermek için. Uygun pozlama süresinden sonra, bir fosforimager kullanılarak Fosfor ekranını tarayın. <ol><li> Phosphorimager üreticisi tarafından sağlanan talimatları kullanarak Fosfor ekranını tarayın. </li><li> Her bir zaman noktasında mRNA ölçmek. ImageQuant yazılım veya ilgili yazılım kullanarak mRNA düzeylerini ölçmek. Yükleme kontrolü için her bir zaman noktasında mRNA normalize edilir. SCR1 yükleme olarak kullanılmışsaKontrol, SCR1 için yarılanma ömrü Northerns normalleştirmek. </li><li> mRNA bir yarılanma ömrü alanına 0 mRNA mevcut miktarıyla her zaman noktasında kalan mRNA miktarını (ilk zaman noktası) bölünmesi ile hesaplanır. Semilogaritmik arsa (Şekil 2C) üzerine, zamana karşı olarak kalan mRNA grafik. Aşağıdaki denklem ile mRNA yarı ömürleri hesaplayın: t 1/2 = -0,693 / k (negatif 0.693) </li><li> k en uygun doğrunun eğimi ve t 1/2 mRNA yarı-ömrü. </li></ol>

<ol>
	<li>Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+RNA+polymerase+conditional+mutant+that+rapidly+ceases+mRNA+synthesis.">Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).</li><li>Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mRNA+stability+and+length+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).</li><li>Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+action+of+thiolutin,+an+inhibitor+of+macromolecular+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .</li><li>Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Comparison+of+stable+and+unstable+mRNAs+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .</li><li>Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Analysis+of+mRNA+Stability+Using+Transcription+Inhibitors+and+Microarrays+Reveals+Postranscriptional+Control+of+Ribosome+Biogenesis+Factors.">Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors.</a> Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).</li><li>Tani, H., Akimitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+technology+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).</li><li>Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+inhibitor+thiolutin+blocks+mRNA+degradation+in+yeast.">The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast.</a> Yeast. 25, 85-92 (2008).</li><li>Kervestin, S., Jacobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMD:+a+multifaceted+response+to+premature+translational+termination.">NMD: a multifaceted response to premature translational termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).</li><li>Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Polymerase+II+subunit+composition,+stoichiometry+and+phosphorylation.">RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation.</a> Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).</li><li>Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+affects+relative+nonsense+mRNA+accumulation+in+wild-type+and+upf+mutant+yeast+strains+Current+Genetics).">Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics).</a> 43, 171-177 (2003).</li><li>Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae.</a> Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).</li><li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+measuring+mRNA+Decay+Rate+in+Saccharomycescerevisiae.">Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

MRNA sentezinin ve yeni sentez yokluğunda mRNA değişmesi takip durdurulması sıklıkla mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. S. cerevisiae RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe mRNA bozunma oranları ölçümü en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntem, özellikle, RNA polimeraz II inhibe eder. Bu tekniği kullanarak, mRNA bozulma oranlarının belirlenmesi için en kritik adımlar şunlardır: 1) maya hücreleri hasat önce, bu tr...

transkripsiyon ve spesifik mRNA bozunma gen ekspresyonunun önemli belirleyicilerdir. sentez ve özel mRNA&#39;ların çürüme oranı o mRNA kararlı durum seviyesini belirler. mRNA&#39;lann kararlı durum düzeyleri mRNA bereket yöneten ve protein sentezi için ne kadar her mRNA belirler. MRNA yarı hayatımızın Ölçümler mRNA çürüme hızını belirlemek için yoğun olarak kullanılmaktadır. MRNA, mRNA ve çevre koşulları ile kodlanan proteinin fonksiyon özellikleri ile ilgili farklı oranlarda özel mRNA&#39;lar bozunma. MRNA bozulma oranlarını belirlemek için kullanılan tekniğe bağlı olarak, çürüme hızı ölçümleri ya küresel ya da bireysel transkript için tespit edilebilir. Maya S. olarak cerevisiae, yaygın genel mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan teknikler, RNA polimeraz II ve kimyasal transkripsivonel sıcaklığa duyarlı allel barındıran bir maya suşu kullanılarak içerirBu tür thiolutin ve 1,10-fenantrolin 1-5 gibi riptional inhibitörleri yer alır. Bu yöntemler ferdi mRNA bozunma hızını 4 ölçmek için kullanılabilir. Diğer yöntemler, ayrıca, mRNA&#39;nın bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemler, kararlı durum etiketleme veya yalnızca belirli koşullarda eksprese edilen bir düzenlenmiş arttırıcının eksprese edilen mRNA moleküllerinin kullanımına yolla uygulanabilir. Bu tekniklerin her biri belirli avantajlara ve sınırlamalar vardır. Burada anlatılan teknik, RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel kullanmaktadır. Bu yöntem, S. kullanır cerevisiae modeli olarak, spesifik transkripsiyon inhibisyon teknikleri 6 kullanan diğer sistemlerde değiştirilmiş ve kullanılmıştır ama. RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile mRNA yarı ömrü ölçümleri kapsamlı mRNA bozulma 4-5 iki genom ve tek tek ölçümler için kullanılmıştır. Bu teknik, bir Belir kullanımını gerektirirRNA polimeraz II, rpb1-1 1 &#39;in bir sıcaklığa duyarlı allel barındırır ic maya suşu. Bu teknik için mantık infeksiyona izin vermeyen sıcaklık sıcaklığa duyarlı maya soyunun maruz mRNA sentezini inhibe olmasıdır. Transkripsiyon inhibe sonra Daha sonra, önceden mevcut olan mRNA çürüme farklı zaman noktalarında izlenir. önceden var olan mRNA kaybolması transkripsiyon kapatıldıktan sonra farklı zaman noktalarında, maya hücrelerinden RNA ekstre ederek izlenir. maya hücreleri hasat olduğu zaman noktaları pilot deney tarafından önceden belirlenmiş ve transkript ve sistem araştırılıyor bağlıdır edilmektedir. Daha uzun bir zaman noktaları uzun yaşayan transkript için kullanılır ise daha hızlı zaman noktalarında, kısa ömürlü transkript için kullanılır. Daha sonra, mRNA&#39;nın çürüme ya da Kuzey benek analizi, kantitatif PCR ya da RNAseq ile izlenir. Bir te kullanarak mRNA yarı ömürleri ÖlçümüRNA polimeraz II mperature duyarlı allel avantajları vardır. Öncelikle, bu teknik yalındır kolay ve. İkinci olarak, maya cinsi, mRNA, yarı ömrü ölçümleri değişik büyüme koşulları belirlenebilir laboratuarda elde edilen veya oluşturulan bir kez; mRNA çürüme çevre etkisinin belirlenmesi sağlayan. Üçüncü olarak, mRNA, bozunma oranları genom izlenebilir. Diğer transkripsiyon önleme tekniklerinin kullanımı da avantajları ve sınırlamaları vardır. Örneğin, bir uyarılabilir promoterin kullanılması düzenlenmiş bir arttırıcının kontrolü altında olan bir mRNA üretmek üzere subklonlama gerektirir. Thiolutin hazır değil ve zaman pahalı kullanılabilir. Ayrıca, eylem thiolutin en modu tam olarak anlaşılamamış ve mRNA çürüme 7 inhibe dahil olmak üzere diğer hücresel süreçleri etkilediği bildirilmiştir. Seçenek olarak ise, 1,10-fenantrolin, daha kolaylıkla temin edilebilir. Bundan başka, tüm teknikler pert olabilir transkripsiyonunu inhibe etmek için kullanılırHücresel fonksiyonu URB ve farklı şekillerde farklı mRNA&#39;ları etkileyebilir. Bir araştırmacı, en güvenilir sonuçlar elde etmek için deneysel koşullarda kullanmak için en uygun yöntemi belirlemek gerekiyor. Uygulama için en uygun olan yöntem belirlemek için, bir araştırmacı araştırılmaktadır transkript tarafından kodlanan proteinlerin transkript ve işlevini tanımlamak gerekiyor. en güvenilir mRNA çürüme oranı ölçümleri birden teknikler kullanılarak ve aynı çürüme oranı gösteriyor belirlenir olanlardır. Tek bir tekniktir her zaman en iyi ve en uygun tekniği özel duruma bağlıdır. S. sayısız çalışma cerevisiae çeşitli koşullarda ve genetik geçmişleri mRNA çürüme oranları ölçüldü. mRNA çürüme oranları ölçülür olduğu koşulların belirli deney araştırılıyor bağlıdır. Koşullar olmanın olsun farklı hücresel ortamlarda mRNA bozulma oranlarını Ölçme belirlertercihen özel mRNA bozulma oranlarını etkileyen incelenir. mRNA çürüme oranları da kullanılan maya suşu bağlı olarak değişebilir. Örneğin mRNA, bozunma oranları işlevsiz bir saçma kaynaklı mRNA azalma (NMD) yolu ile yabani tip maya hücreleri ve maya hücreleri belirlenebilir. Bu mRNA bozulması yolu şimdiye kadar incelenmiş tüm ökaryot organizmalarda bulunan ve erken çeviri 8 sonlandırmak mRNAların bozulmasını tetikler. NMD başlangıçta erken sonlandırma edilen ya da anlamsız kodonlanyla mRNA&#39;ları düşürür bir yol olarak tespit edilmiştir, ama şimdi de doğal mRNA&#39;ları içermeyen saçmalık ifadesini düzenleyen bir yol olarak kabul edilmektedir. yolunun hedefleri mRNA&#39;lar hızla fonksiyonel NMD yolu ile maya hücrelerinde parçalanır ve fonksiyonel olmayan NMD yolu ile maya hücrelerinde stabilize edilir. Bu nedenle, bu yolağın doğrudan hedefleri olan mRNA yarı-ömürleri, yabani tip maya cel daha kısadır veBir fonksiyonel olmayan NMD yolu ile, maya hücreleri ile karşılaştırıldığında mi.

<table><tbody><tr><td>High Speed Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Genescreen Plus membrane</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon phosphorimager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&amp;deg; for 1 hour</td></tr><tr><td>NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td><td></td><td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA kararlı durum düzeyleri çevresel koşullara bağlı olarak değişir. Bir mRNA&#39;nın kararlı durum birikimi seviyelerinin düzenlenmesi proteinin doğru miktarı, hücrenin özel büyüme koşulları için sentez edilmesini sağlar. MRNA bozulma oranlarını ölçmek için bir yaklaşım transkripsiyonu inhibe ve daha sonra zaten mevcut mRNA kaybolması izleme olduğunu. mRNA azalma oranını daha sonra tayin edilebilir ve doğru bir yarı ömür çeşitli teknikler kullanılarak tespit edilebilir. S. cerevisiae yarı ömürleri geliştirilmiştir mRNA ölçmek ve RNA polimeraz II, rpb1-1 bir sıcaklığa duyarlı allel liman suşları kullanılarak mRNA&#39;nın transkripsiyonunu inhibe içerir protokolleri. Bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında kodlayan mRNA kullanılarak yarı ömürleri gibi alternatif thiolutin veya 1,10-fenantrolin gibi veya kopyalama önleyicileri ile transkripsiyonu inhibe içerir mRNA ölçmek için diğer teknikler,Bu tür galaktoz ile uyarılabilir promoteri ve TET off sistemi. Burada, biz S. ölçümü tanımlamak RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile cerevisiae mRNA bozunma oranları. Bu teknik, tek tek mRNA ya da genom çapında mRNA bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir.

<html> RNA ve kuzey blotting ayıklanması sırasında doğru mRNA bozulma oranlarını ölçmek için bu protokolün yeteneği RNazsız tekniklerin transkripsiyonu inhibe, uygun zaman noktalarında maya hücreleri hasat ve kullanımına bağlıdır. Sırasıyla, stabil olmayan ve kararlı olduğu bilinmektedir iki kontrol mRNA araştırmayı deney çalışan güven sağlar. Örneğin, bu ve mRNA ön CYH2 iki tespit eden bir prob ile tarama gerçekleştirilebilir oluşturulmaktadır. Şekil 2B, ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains at JoVE.com

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Belirli mRNA&#39;ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA&#39;nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.5K Görüntüleme.  Baylor University.  Belirli mRNA'ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA'nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor. 

Video: Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Maya S. cerevisiae hipoksik yanıt sırasında zamanla mRNA düzeyleri ölçme

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Genetik

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

Genom çapında transkript çürüme oranları Proliferasyona ve durgun insan fibroblast belirleme

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Biyokimya

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be bound by many different RBPs that will regulate its production, stability, activity, and degradation. As such, much has been done to understand the dynamics that exist between these two types of molecules. A particularly important breakthrough came with the emergence of &#8216;cross-linking and immunoprecipitation&#8217; (CLIP). This technique allowed stringent investigation into which RNAs are bound by a particular RBP. In short, the protein of interest is UV cross-linked to its RNA substrates in vivo, purified under highly stringent conditions, and then the RNAs covalently cross-linked to the protein are converted into cDNA libraries and sequenced. Since its conception, many derivative techniques have been developed in order to make CLIP amenable to particular fields of study. However, cross-linking using ultraviolet light is notoriously inefficient. This results in extended exposure times that make the temporal study of RBP-RNA interactions impossible. To overcome this issue, we recently designed and built much-improved UV irradiation and cell harvesting devices. Using these new tools, we developed a protocol for time-resolved analyses of RBP-RNA interactions in living cells at high temporal resolution: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (&#967;CRAC). We recently used this technique to study the role of yeast RBPs in nutrient stress adaptation. This manuscript provides a detailed overview of the &#967;CRAC method and presents recent results obtained with the Nrd1 RBP.

Kinetic cross-linking and analysis of cDNA is a method that allows investigation of the dynamics of protein-RNA interactions in living cells at high temporal resolution. Here the protocol is described in detail, including the growth of yeast cells, UV cross-linking, harvesting, protein purification, and next generation sequencing library preparation steps.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Belirli ve verimli protein tükenmesi elde etmek için bozulma ayarlama

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Biyoloji

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this yeast model is relevant to many organisms, including humans, since DNA repair and DNA damage response factors are well conserved across diverse species. However, S. cerevisiae has not yet been used to fully address whether the rate of accumulating mutations changes with increasing replicative (mitotic) age due to technical constraints. For instance, measurements of yeast replicative lifespan through micromanipulation involve very small populations of cells, which prohibit detection of rare mutations. Genetic methods to enrich for mother cells in populations by inducing death of daughter cells have been developed, but population sizes are still limited by the frequency with which random mutations that compromise the selection systems occur. The current protocol takes advantage of magnetic sorting of surface-labeled yeast mother cells to obtain large enough populations of aging mother cells to quantify rare mutations through phenotypic selections. Mutation rates, measured through fluctuation tests, and mutation frequencies are first established for young cells and used to predict the frequency of mutations in mother cells of various replicative ages. Mutation frequencies are then determined for sorted mother cells, and the age of the mother cells is determined using flow cytometry by staining with a fluorescent reagent that detects bud scars formed on their cell surfaces during cell division. Comparison of predicted mutation frequencies based on the number of cell divisions to the frequencies experimentally observed for mother cells of a given replicative age can then identify whether there are age-related changes in the rate of accumulating mutations. Variations of this basic protocol provide the means to investigate the influence of alterations in specific gene functions or specific environmental conditions on mutation accumulation to address mechanisms underlying genome instability during replicative aging.

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Mutation rates in young Saccharomyces cerevisiae cells measured through fluctuation tests are used to predict mutation frequencies for mother cells of different replicative ages. Magnetic sorting and flow cytometry are then used to measure actual mutation frequencies and age of mother cells to identify any deviations from predicted mutation frequencies.

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler