Bu nanopore tabanlı algılama yöntemi fiziksel olarak karakterize ve bireysel molekülleri tanımlamak için potansiyel göstermiştir. Bu videonun amacı olan metallo-nano partiküllerle çalışmak, ölçümün doğruluğunu ve hassasiyetini neyin sınırladığına ilişkin anlayışımızı zorluyor. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu cihazın geleneksel lipid çift katmanlı bellek kurulumundan daha fazla bant genişliğine sahip olmasıdır, bu da nanopore'da daha hızlı sonuçlar ve daha fazla reaksiyon görmemizi sağlar.
Bu teknik mümkün kılındı çünkü 1990'ların başında protein nanogözeneklerinde gating, yani farklı durumlar arasında geçiş, kontrol edilebilir ve moleküller gözenek duvarına bağlanabilirsiniz gösterilmiştir. Bu teknik, en az örnek kullandığı için ticari DNA dizileme uygulamaları için geliştirilmektedir. Floresan etiketler gerektirmez ve geleneksel yöntemlere göre çok daha uzun okuma uzunlukları kullanır.
Bu teknik aynı zamanda polimerler arasında jel elektroforez ve kromatografiden daha fazla doğruluk ve hıza göre büyüklüklerine göre ayrım yapmak için geliştirilmiştir. İlk olarak, elektrolit olarak ultrasaf suda tek molar sodyum klorür ve 10 milimolar monosodyum fosfat çözeltisi 500 mililitre hazırlayın. Bu özel kurulum ile taze çözümler ve numuneler kullanmak en iyisidir.
Buna ek olarak, yüksek kaliteli deiyonize su başarıyla membranlar oluşturmak için çok önemli olduğunu bulundu. Sonra, bir miligram lyophilized yabani tip monomerik S.aureus alfa hemoliz in tozu ile ultrasaf su bir mililitre birleştirin. Staph aureus alfa hemolizin toksin proteini ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın.
Bu yordamı gerçekleştirirken MSDS'deki önlemleri uygulayın. Sonra, bir cam Scintillation vial endecaine mililitre DPhyPC başına beş mililitre dört mililitre hazırlamak. Şişeyi politetrafloroetilen kaplı bir kapakla kaplayın ve bir aya kadar dört santigrat derecede saklayın.
Bundan sonra, 12 fosfotungstik asit hidrat 57.6 miligram çözün elektrolit 10 mililitre iki milimolar polioksometalate çözeltisi yapmak için. POM çözeltisini iki beş mililitrelik porsiyona bölün. Bir POM çözeltisinin pH'ını 5,5'e ayarlamak için üç molar sodyum hidroksit kullanın.
Test için hazırlanmaya başlamak için, düzlemsel lipid çift katmanlı elektrofizyoloji cihazının test hücresini monte edin. İlk olarak, 600 grit zımpara ile gümüş bir tel aşındırın ve gümüş-gümüş klorür tel elektrot yapmak için 10 dakika boyunca ticari olarak kullanılabilir sodyum hipoklorit bazlı çamaşır suyu emmek. Cihazın kuvars kılcal damarına takmadan önce tel elektrodu durulayın ve kurulayın.
Elektrodu kuvars-nanopore membranveya QNM içinde saklayın, kılcal ve rezervuar ayıran. Sonra rezervuar gümüş bir tel üzerine monte silindirik gümüş-gümüş klorür pelet elektrot yerleştirin. Her iki elektrotu amplifikatör devre kartına bağlayın.
Ardından, veri toplama programını açın ve güç kaynağını sıfır milivoltta başlatın. Boş hücredeki elektrotlar arasında DC akımı tespit edilmediğini doğrulayın. Bu gösteri sırasında transkapiller basıncın membran oluşumunu ve sonraki nanopore oluşumunu nasıl etkileyebildiğini izlemek önemlidir.
Bu iki adımı doğru yapmadan, denemeler çalışmaz. Bir şırınga içine elektrolit yaklaşık bir mililitre yükleyin ve rezervuarbağlı sıvı hattına bağlayın. QNM yüzü batırılıncaya kadar rezervuara elektrolit ekleyin, amplifikörü doyuran elektrotlar arasındaki iyonik akımla gösterildiği gibi.
Amplifikatör doygunluk etmezse, artı veya eksi bir voltluk bir pop voltajı uygulayarak veya kılcal basıncı yaklaşık 300 milimetre cıva artırarak QNM'yi açın. Gerekirse her iki tekniği de kullanın. Amplifikatör doygunolduktan sonra, çözelti seviyeleri sıfıra dönen akımla belirtildiği gibi QNM'nin altına düşene kadar rezervuardan elektroliti çekin.
Lipid çift katmanlı oluşum sürecine başlamak için, elektrolit çözeltisi seviyesini QNM'nin yüzünün çok üzerinde yükseltin ve ne kadar çözelti aldığına dikkat edin. Daha sonra DPHyPC çözeltisine 10 mikrolitrelik pipet ucunu batırın ve tüm görünür lipiti ucun içine çekin. Pipetin ucuna elektrolit çözeltisinin yüzeyine dokunun ve yağın pipetten hava-su arabirimi boyunca akmasını bekleyin.
Lipidin çözeltiboyunca eşit olarak yayılması için 2-5 dakika bekleyin. Daha sonra, çözeltinin yüzeyi QNM'nin altına gelene kadar elektroliti yavaşça çekin ve sonra çözeltiyi yalıtkan lipid çift katmanlı membranı oluşturmak için QNM'nin üzerine çıkaracak kadar elektrolit ekleyin. İki katmanlı üç denemeden sonra oluşmazsa, daha önce açıklandığı gibi lipid başka bir kısmını uygulayın ve işlemi tekrarlayın.
Bir kez iki katmanlı oluşmuş gibi görünüyor, iki katmanlı pop ve daha sonra yavaş yavaş düşürerek ve daha önce olduğu gibi aynı şekilde çözüm düzeyini yükselterek reform kılcal basıncı artırmak. QNM'nin tıkanmamış ve çift katmanlı bir biçim oluşturduğundan emin olmak için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Sonra, buz veya oda sıcaklığında alfa hemoliziin protein bir aliquot eritme.
Rezervuarı 250 nanogram monomerik alfa hemolizisin proteini ve yaklaşık 250 mikrolitre ultrasaf su ile doldurun. Daha sonra, gözenek oluşumunu tetiklemek için 200 ila 400 milivolt önyargı uygulayın. Gözenek oluşumunu kolaylaştırmak için, qnm iki katmanlı genişletmek için cıva 40 ila 200 milimetre kılcal basıncı artırmak.
Bir nanopore oluşur, ölçüm gerilimine uygulanan önyargıyı azaltmak ve ekleme basıncının yaklaşık yarısına basıncı azaltmak. Teste başlamak için, uygulanan potansiyel sıfıra ayarlandığında ölçülen akım olmadığından emin olmak için DC-ofset gerilimini yeniden ayarlayın. Daha sonra, rezervuara göre 120 ila negatif 120 milivolt luk bir uygulama potansiyeli için iyonik akım izi edinin.
Spontan akım ablukaları ile gösterilir hiçbir kirletici olduğunu doğrulayın. Rezervuara 1 ila 6 mikrolitre pH 5.5 iki milimolar POM küme çözeltisi ekleyin. Negatif 120 milivoltluk bir uygulama geriliminde iyonik akım zaman serisi ölçümleri uygulayın.
Alfa hemolysin kanalı üzerinden bireysel aniyonik fosfotungstik asit moleküllerinin hareketi yaklaşık% 80 ortalama açık gözenek iyonik akım azaldı geçici bloklar üretti süresi ve abluka akımı hem doğrudan parçacık-gözenek etkileşimi ile ilgili, iyonik türlerin göreceli abluka derinlik oranları histogramlarında ayırt edilmesine izin. pH 5.5'te derinlik oranları 0.06 ve 0.16 olan iki tepe gözlendi. Fosforlu NMR'ye göre, küçük tepe altı eksi fosfotungstate türü, en büyük tepe ise yedi eksili türdü.
pH 7.5'te göreli konsantrasyonlar 6 eksitin yedi eksi türüne oranı daha yüksektir. pH 5.5'e göre abluka olaylarındaki 20 kat azalması, serbest fosfat ve tungstate iyonlarının bozulmasına bağlandı. İkamet zamanı dağılımlarının uygun lanması, her iyonik türdeki birden fazla parçacık gözenek etkileşimini gösteren birden fazla üstel fonksiyon gerektiriyordu.
pH 7.5'teki daha kısa ikamet süreleri, alfa hemoliz kanalı lümeninin içinde veya yakınında bulunan sabit yüklerin göreceli sayısında pH'ya bağlı değişiklikleri gösteren önceki çalışmalarla tutarlı olarak pH 5.5'e göre daha zayıf parçacık gözenek etkileşimlerini ortaya sürmüştür. Yüksek saflıkta deiyonize su bu özel kurulum için çok önemlidir. Harcanan organik filtre kartuşu, laboratuarımızın Aylarca QNM'lerde membran oluşturamamasına neden oldu.
Membranlar çok küçük ve oluşturmak için nanopores almak için bir hile var, çünkü yöntemin bu özel sürümü ne yeni bireyler de mücadele edebilir. Onlarca yıl önce başlatılan bu yöntem, iyonları, nükleik asitleri ve sentetik polimerleri ve DNA dizileminin analizinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca biyofizik ve temel hücre biyolojisi uygulamaları bulabilirsiniz.
Örneğin, bu prosedür sentetik polimerlerin ve biyopolimerlerin fiziksel özelliklerini incelemek ve boyutlarını, diğer moleküllerle etkileşimlerini ve diğer önemli soruları araştırmak için kullanılabilir.
