Bu protokolü tüberküloza karşı yeni aşı adaylarını aramak için kullanıyoruz ama diğer bulaşıcı hastalıklara da başvurabiliyorum. Memeli modelleri ile karşılaştırıldığında bu yöntem yeni DNA tabanlı aşı adaylarının ön tarama için uygun maliyetli bir prosedür sağlar. Prosedürü gösteren Hannaleena Piippo, laboratuarımızdan bir teknisyen.
Başlamak için, cam kılcal damarı kutup çubuğundaki V-oluğuna ayarlayın ve sıkma bileği hafifçe sıkın. Filament yanında tutucu hareket ettirin ve yavaşça filament ile ve filament diğer tarafında kutup çubuğuna kılcal itin. Ardından, kelepçe düğmelerini sıkın, güvenlik camı aşağı ayarlayın ve çekme düğmesine basın.
Bundan sonra, iğne uçlarını korumak için bir Petri kabının içine yeniden kullanılabilir yapıştırıcı parçası üzerine iğneyerleştirin. İlk olarak, doz başına plazmid 0,5 ila 12 mikrogram kullanarak enjeksiyon karışımı hazırlayın. Gruptaki balık sayısı için ana karışımın uygun hacmini hazırlayın.
Kapiller iğneyi bir bant parçasının yapışkan tarafına uygun tutucuya yerleştirin. Sonra, plazmid dozlarda pipet damlacıkları laboratuvar film bir parça üzerine. Bundan sonra, plazmid damlalarını filmden iğneye aktarmak için bir yükleme ucu kullanın.
Pipet yavaş ve dikkatli bir şekilde iğne içine hava kabarcıkları boru önlemek için. Mikro manipülatörü ve Bir ışık kaynağını konumlandırın. Daha sonra hava basıncı musluğunu açık konuma getirin.
Mikro enjektör ön panelinde darbe uzunluğunu zamanlanmış modu kullanarak 10 saniyeye ayarlayın. Daha sonra, 10 dönüşlü periyot kadranı ile darbe uzunluğunu hassas bir şekilde ayarlayın. Daha sonra, mikro manipülatör mikro pipet tutucu üzerine iğne ayarlayın.
Sıvının dışarı itilmesine izin vermek için iğnenin ucunu kesmek için cımbız kullanın ve iğnenin konumunu değerlendirmek için bir mikroskop kullanın. Bir saniyelik bir darbenin iğneden küçük bir damlacığı dışarı ittinden emin olmak için uzaktan ayak düğmesine bir kez basın. Daha sonra elektroporatör ayarlarını ayarlayın ve cımbızı elektroporatöre bağlayın.
Enjeksiyon sırasında balık sabit bir pozisyonda tutmak için dolgu olarak ortasında kesilmiş bir oluk ile sünger bir parça kullanın. Süngeri sistem suyuna iyice batırın ve petri kabına koyun. Plastik bir kaşık kullanarak, oluk aşağı balık ventral tarafı ile ıslak sünger bir anestezi zebra balığı aktarın.
Mikroskop altında zebrabalığının sırt kasına yakın 45 derecelik bir açıyla iğne yerleştirin, sonra sırt yüzgeci önünde ölçekler olmadan küçük bir nokta bulmak ve kas içine iğne itin. Herhangi bir direnç hissedilirse bitişik bir nokta deneyin. Yavaş yavaş kas içine plazmid çözeltisi enjekte etmek için ayak anahtarı kullanın.
Mikroskop altında fenol kırmızı kas dokusu girer gibi görünür olmalıdır. Enjeksiyon alanının her iki tarafına cızırdak tipi elektrotlar yerleştirerek balıkları enjeksiyondan hemen hemen sonra elektroporate edin. Elektroporatörün başlangıç düğmesine basın ve altı adet 40 volt 50 milisaniyelik darbe verin.
Daha sonra balığı yavaşça bir kurtarma tankına aktarın. Son olarak, metin protokolüne göre balık analiz sonra, enjeksiyon sitesi yakınında EGFP ifade görmek için bir UV ışığı kullanın. Bu protokolde DNA antijenleri ifade vektöründe GFP'ye bitişik klonlandı.
Zebra balığına dna antijen plazmidleri bir mikro enjektör le kas içi enjekte edildi ve enjeksiyon bölgesi hücrelere plazmid alımını artırmak için elektroporated edildi. Görüntüleme için antijen ekspresyonu floresan mikroskopisi ile görüntülenebilir. Bu durumda, her üç antijen GFP füzyon proteinlerinin ekspresyonu enjeksiyon bölgesiyakınlarında saptandı, ancak yoğunlukları farklıydı.
Mikobakteriyel antijenlerle bağışıklamadan beş hafta sonra zebra balığına Mycobacterium marinum bulaştı. QPCR enfeksiyondan dört hafta sonra her balıkta bakteri yükünü belirlemek için kullanıldı. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, antijen bir aşılanmış balık M.marinum ile enfeksiyon sonrası azalmış bakteriyel yükler gösterdi.
Bu yöntemi uygularken plazmid yapısını dikkatle tasarlamak, antijenin ekspresyonunu doğrulamak ve büyük ölçekli deneylerden önce enjeksiyon tekniğini uygulamak önemlidir. Bu teknik, yetişkin zebra balıklarında yeni DNA tabanlı aşı adaylarının uygun maliyetli klinik öncesi taramalarının önünü açabilir. Hayvanların refahının çok önemli olduğunu ve bu işlemi yaparken uygun anestezinin şart olduğunu unutmayın.
