Usamos este protocolo para buscar nuevos candidatos a vacunas contra la tuberculosis, pero puedo aplicarlo a otras enfermedades infecciosas. En comparación con los modelos de mamíferos, este método proporciona un procedimiento rentable para el cribado preliminar de nuevos candidatos a vacunas basadas en el ADN. Demostrar el procedimiento estará Hannaleena Piippo, un técnico de nuestro laboratorio.
Para comenzar, ajuste el capilar de vidrio en la ranura en V en la barra polar y apriete ligeramente la perilla de sujeción. Mueva el soporte junto al filamento y empuje suavemente el capilar a través del filamento y hacia la barra polar en el otro lado del filamento. A continuación, apriete las perillas de sujeción, ajuste el cristal de seguridad y pulse el botón de tracción.
Después de esto, coloque las agujas en un pedazo de adhesivo reutilizable dentro de un plato de Petri para proteger las puntas de la aguja. En primer lugar, prepare la mezcla de inyección con 0,5 a 12 microgramos de plásmido por dosis. Preparar el volumen adecuado de mezcla maestra para el número de peces en el grupo.
Coloque la aguja capilar en el lado pegajoso de un trozo de cinta sobre el soporte adecuado. A continuación, las gotas de pipeta de dosis de plásmido en una pieza de película de laboratorio. Después de esto, utilice una punta de carga para transferir las gotas de plásmido de la película a la aguja.
Pipetear lentamente y cuidadosamente para evitar pipetear burbujas de aire en la aguja. Coloque el micromantenador y una fuente de luz. A continuación, cambie el grifo de presión de aire a la posición abierta.
En el panel frontal del microinyectores, ajuste la longitud del pulso a 10 segundos utilizando el modo crono cronolacta. A continuación, ajuste la longitud del pulso con el dial de período de 10 vueltas. A continuación, ponga la aguja en el soporte de la micro pipeta del micro manipulador.
Utilice pinzas para cortar la punta de la aguja para permitir que se expulse el líquido, y utilice un microscopio para evaluar la posición de la aguja. Presione el interruptor del pie remoto una vez para verificar que un pulso de un segundo empuje una pequeña gota fuera de la aguja. A continuación, ajuste los ajustes del electroporador y conecte las pinzas al electroporador.
Para mantener el pescado en una posición fija durante la inyección utilice un pedazo de esponja con una ranura cortada en el medio como relleno. Remoje bien la esponja en agua del sistema y ártela en un plato de Petri. Usando una cuchara de plástico, transfiera un pez cebra anestesiado a la esponja húmeda con el lado ventral del pez hacia abajo en el surco.
Bajo el microscopio coloque la aguja en un ángulo de 45 grados cerca del músculo dorsal del pez cebra, luego encuentre el pequeño punto sin escamas delante de la aleta dorsal y empuje la aguja hacia el músculo. Si se siente alguna resistencia, pruebe un lugar adyacente. Utilice el interruptor del pie para inyectar gradualmente la solución de plásmido en el músculo.
Bajo el microscopio, el rojo fenol debe ser visible al entrar en el tejido muscular. Electroporar el pescado inmediatamente después de la inyección colocando los electrodos de tipo pinza a cada lado del lugar de inyección. Pulse el botón de inicio del electroporador y déle seis pulsos de 40 voltios y 50 milisegundos.
Luego, transfiera suavemente el pescado a un tanque de recuperación. Finalmente, después de anatiizar el pescado de acuerdo con el protocolo de texto, utilice una luz UV para ver la expresión EGFP cerca del lugar de inyección. En este protocolo, los antígenos de ADN fueron clonados adyacentes a GFP en el vector de expresión.
El pez cebra se inyectó los plásmidos antígenos de ADN por vía intramuscular con un microinyección, y el lugar de inyección fue electroporado para mejorar la ingesta de plásmidos en las células. Para la toma de imágenes, la expresión de antígenos se puede visualizar con microscopía de fluorescencia. En este caso, la expresión de las tres proteínas de fusión de GFP de antígeno se detectó cerca del lugar de inyección, aunque su intensidad varió.
Cinco semanas después de la inmunización con antígenos micobacterianos, el pez cebra se infectó con Mycobacterium marinum. QPCR se utilizó para determinar la carga bacteriana en cada pez cuatro semanas después de la infección. En comparación con el grupo de control, el pez inmunizado con el antígeno uno mostró una disminución de las cargas bacterianas después de la infección con M.marinum.
Al realizar este método es importante diseñar la construcción del plásmido cuidadosamente, validar la expresión del antígeno y practicar la técnica de inyección antes de los experimentos a gran escala. Esta técnica puede allanar el camino para el cribado preclínica rentable de nuevos candidatos a vacunas basadas en ADN en peces cebras adultos. No olvide que el bienestar de los animales es muy importante, y la anestesia adecuada es esencial durante la realización de este procedimiento.
