우리는 결핵에 대하여 새로운 백신 후보를 찾아기 위하여 이 프로토콜을 이용합니다, 그러나 나는 그밖 전염병에 적용될 수 있습니다. 포유류 모델에 비해이 방법은 새로운 DNA 기반 백신 후보의 예비 심사를위한 비용 효율적인 절차를 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자 인 한날레나 피포 (Hannaleena Piippo)가 될 것입니다.
먼저 유리 모세관을 극지 막대의 V-홈에 넣고 클램핑 노브를 가볍게 조입니다. 필라멘트 옆에 있는 홀더를 움직여 필라멘트를 통해 모세관을 부드럽게 밀어 필라멘트 반대편에 있는 극지 막대로 밀어 넣습니다. 다음으로 클램핑 노브를 조이고 안전 유리를 내려 놓고 당기기 버튼을 누릅니다.
그런 다음 바늘 끝을 보호하기 위해 페트리 접시 안에 재사용 가능한 접착제 조각에 바늘을 놓습니다. 먼저, 투여량당 플라스미드의 0.5~12마이크로그램을 사용하여 주사 믹스를 준비한다. 그룹의 물고기 수에 대한 마스터 믹스의 적절한 볼륨을 준비합니다.
모세관 바늘을 테이프 조각의 끈적끈적한 면에 적절한 홀더에 놓습니다. 다음으로, 플라스미드 용량의 파이펫 방울은 실험실 필름의 조각에. 그 후, 로딩 팁을 사용하여 필름에서 플라스미드 방울을 바늘로 옮길 수 있습니다.
파이펫은 공기 거품을 바늘로 피포팅하지 않도록 천천히 조심스럽게 피펫합니다. 마이크로 조작기와 광원을 배치합니다. 그런 다음 공기 압력 탭을 열린 위치로 전환합니다.
마이크로 인젝터 전면 패널에서 시간 제 모드를 사용하여 펄스 길이를 10초로 조정합니다. 그런 다음 10턴 기간 다이얼로 펄스 길이를 미세 조정합니다. 다음으로, 마이크로 조작기의 마이크로 파이펫 홀더에 바늘을 설정합니다.
핀셋을 사용하여 바늘 끝을 잘라 액체가 밀어 낼 수 있도록 하고 현미경을 사용하여 바늘의 위치를 평가합니다. 리모컨 스위치를 한 번 눌러 1초 펄스가 바늘에서 작은 물방울을 밀어내는지 확인합니다. 그런 다음 전기 포로이터 설정을 조정하고 핀셋을 전기 포로이터에 연결합니다.
주입 하는 동안 고정 된 위치에 물고기를 유지 하려면 패딩으로 중간에 그루브 컷 스폰지의 조각을 사용 하 여. 스폰지를 시스템 물에 철저히 담그고 페트리 접시에 넣습니다. 플라스틱 숟가락을 사용하여 마취 된 얼룩말 물고기를 젖은 스폰지에 옮기고 물고기의 복부 면을 홈에 옮길 수 있습니다.
현미경의 밑에 바늘을 얼룩말 피시의 등쪽 근육에 가까운 45도 각도로 놓고, 등지느러미 앞에 비늘없이 작은 자리를 찾아 근육에 바늘을 밀어 넣습니다. 저항이 느껴지면 인접한 지점을 시도하십시오. 발 스위치를 사용하여 근육에 플라스미드 용액을 점차적으로 주입하십시오.
현미경의 밑에 페놀 빨강은 근육 조직을 입력할 때 표시되어야 합니다. 주사 부위의 각 측면에 트위저 형 전극을 배치하여 주입 직후 물고기를 전기화합니다. 전기 포레이터의 시작 버튼을 누르고 6 개의 40 볼트 50 밀리초 펄스를 제공합니다.
그런 다음 물고기를 복구 탱크로 부드럽게 옮길 수 있습니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 물고기를 마취한 후 UV 라이트를 사용하여 주입 부위 근처에서 EGFP 발현을 볼 수 있습니다. 이 프로토콜에서, DNA 항원들은 발현 벡터에서 GFP에 인접하여 복제되었다.
Zebrafish는 마이크로 인젝터와 근육질로 DNA 항원 플라스미드를 주입하고, 주사 부위는 세포내로 플라스미드의 섭취를 개선하기 위해 전기화되었다. 이미징의 경우 항원 발현은 형광 현미경 검사로 시각화될 수 있습니다. 이 경우, 3가지 항원 GFP 융합 단백질의 발현은 주사 부위 근처에서 검출되었지만, 그들의 강도는 다양했다.
진균 항원으로 예방 접종 후 5 주 제브라피쉬는 진균 마리눔에 감염되었습니다. QPCR은 감염 후 4주 후에 각 물고기의 세균 부담을 결정하는 데 사용되었습니다. 대조군에 비해 항원으로 면역화된 물고기는 M.marinum감염 후 세균부하가 감소하는 것으로 나타났다.
이 방법을 수행하면서 플라스미드 구조를 신중하게 설계하고, 항원의 발현을 검증하고, 대규모 실험 전에 주입 기술을 연습하는 것이 중요하다. 이 기술은 성인 얼룩말피에서 새로운 DNA 기지를 둔 백신 후보의 비용 효과적인 전임상 검열을 위한 도로를 포장할 수 있습니다. 동물의 복지가 매우 중요하며, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 마취가 필수적이라는 것을 잊지 마십시오.
