אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לחפש מועמדים לחיסון חדשני נגד שחפת, אבל אני יכול להיות מיושם על מחלות זיהומיות אחרות. בהשוואה למודלים של יונקים שיטה זו מספקת הליך חסכוני להקרנה ראשונית של מועמדים חדשים לחיסון מבוסס DNA. הדגימה של ההליך תהיה הנלינה פייפפו, טכנאית מהמעבדה שלנו.
כדי להתחיל, להגדיר את נימי הזכוכית לתוך חריץ V בבר הקוטב ולהדק את ידית ההידוק קלות. הזז את המחזיק ליד נימי בעדינות לדחוף את נימי דרך נימי לתוך בר הקוטב בצד השני של נימי. לאחר מכן, הדקו את ידיות ההידוק, קבעו את זכוכית הבטיחות, ולחץ על כפתור המשיכה.
לאחר מכן, מניחים את המחטים על חתיכת דבק לשימוש חוזר בתוך צלחת פטרי כדי להגן על קצות המחט. ראשית, להכין את תערובת ההזרקה באמצעות 0.5 כדי 12 מיקרוגרם של פלסמיד למנה. הכן את הנפח המתאים של תערובת הורים עבור מספר הדגים בקבוצה.
מניחים את מחט נימי בצד הדביק של פיסת קלטת על המחזיק המתאים. לאחר מכן, טיפות פיפטה של מינונים פלסמיד על פיסת סרט מעבדה. לאחר מכן, השתמש בקצה טעינה כדי להעביר את טיפות פלסמיד מהסרט לתוך המחט.
פיפטה לאט ובזהירות כדי למנוע צינורות בועות אוויר לתוך המחט. מקם את המיקרו מניפולטור ומקור אור. לאחר מכן החלף את ברז לחץ האוויר למיקום הפתוח.
בלוח הקדמי של מזרק מיקרו להתאים את אורך הדופק ל 10 שניות באמצעות מצב מתוזמן. לאחר מכן, כוונן את אורך הדופק באמצעות החיוג לתקופה של 10 תורות. לאחר מכן, הגדר את המחט על מחזיק פיפטה מיקרו של מניפולטור מיקרו.
השתמש פינצטה לחתוך את קצה המחט כדי לאפשר נוזל להיות דחף החוצה, ולהשתמש במיקרוסקופ כדי להעריך את המיקום של המחט. לחץ על מתג הרגל המרוחק פעם אחת כדי לוודא כי פעימה שנייה אחת דוחפת נשירה קטנה מתוך המחט. לאחר מכן התאימו את הגדרות האלקטרופורטור וחברו את פינצטה לאלקטרופורטור.
כדי לשמור על הדג במצב קבוע במהלך ההזרקה להשתמש חתיכת ספוג עם חריץ לחתוך באמצע כמו ריפוד. משרים את הספוג ביסודיות במים מערכתיים ומגדירים אותו בצלחת פטרי. בעזרת כף פלסטיק, מעבירים דג זברה הרדמה לספוג הרטוב עם צד הגחון של הדג למטה בחורב.
מתחת למיקרוסקופ מניחים את המחט בזווית של 45 מעלות קרוב לשריר הגב של דג הזברה, ואז מוצאים את הנקודה הקטנה ללא קשקשים מול סנפיר הגב ודוחקים את המחט לתוך השריר. אם כל התנגדות מורגשת נסה נקודה סמוכה. השתמש במתג כף הרגל כדי להזריק בהדרגה את פתרון הפלסמיד לשריר.
מתחת למיקרוסקופ הפנול האדום צריך להיות גלוי כשהוא נכנס לרקמת השריר. אלקטרופוטם הדג מיד לאחר ההזרקה על ידי הצבת אלקטרודות מסוג פינצטה בכל צד של אתר ההזרקה. לחץ על כפתור ההתחלה באלקטרופורטור ותן לו שישה פולסים של 40 וולט 50 אלפיות שנייה.
לאחר מכן, מעבירים בעדינות את הדגים למיכל התאוששות. לבסוף, לאחר anaethisizing את הדגים על פי פרוטוקול הטקסט, להשתמש באור UV כדי לראות ביטוי EGFP ליד אתר ההזרקה. בפרוטוקול זה, אנטיגנים DNA היו משובטים סמוך GFP בווקטור הביטוי.
דגי זברה הוזרקו עם פלסמידים אנטיגן DNA תוך שרירית עם מזרק מיקרו, ואתר ההזרקה היה electroporated כדי לשפר את צריכת פלסמידים לתוך התאים. להדמיה, ביטוי אנטיגן יכול להיות חזותי עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. במקרה זה, ביטוי של כל שלושת חלבוני היתוך GFP אנטיגן זוהה ליד אתר ההזרקה, אם כי עוצמתם השתנתה.
חמישה שבועות לאחר חיסון עם אנטיגנים mycobacterial הזברה היו נגועים Marinum Mycobacterium. QPCR שימש כדי לקבוע את הנטל החיידקי בכל דג ארבעה שבועות לאחר ההדבקה. בהשוואה לקבוצת הביקורת, הדגים מחוסנים עם אנטיגן אחד הראה ירידה בעומסים חיידקיים לאחר זיהום עם M.marinum.
בעת ביצוע שיטה זו חשוב לעצב את המבנה פלסמיד בזהירות, לאמת את הביטוי של האנטיגן, ולתרגל את טכניקת ההזרקה לפני ניסויים בקנה מידה גדול. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך להקרנה פרה-קלינית חסכונית של מועמדים חדשים לחיסון מבוסס DNA בזברה-דגי זברה בוגרים. אל תשכח כי רווחתם של בעלי החיים חשוב מאוד, הרדמה נכונה היא חיונית בעת ביצוע הליך זה.
