Wir verwenden dieses Protokoll, um nach neuen Impfstoffkandidaten gegen Tuberkulose zu suchen, aber ich kann auf andere Infektionskrankheiten angewendet werden. Im Vergleich zu Säugetiermodellen bietet diese Methode ein kostengünstiges Verfahren für das vorläufige Screening neuartiger DNA-basierter Impfstoffkandidaten. Demonstriert wird das Verfahren von Hannaleena Piippo, einer Technikerin aus unserem Labor.
Zunächst stellen Sie die Glaskapillare in die V-Nut in der Polarstange ein und ziehen Sie den Klemmknopf leicht fest. Bewegen Sie den Halter neben das Filament und drücken Sie die Kapillare vorsichtig durch das Filament und in die Polarstange auf der anderen Seite des Filaments. Ziehen Sie anschließend die Klemmknöpfe fest, legen Sie das Sicherheitsglas ab, und drücken Sie den Zugknopf.
Danach legen Sie die Nadeln auf ein Stück wiederverwendbaren Klebstoff in eine Petrischale, um die Nadelspitzen zu schützen. Bereiten Sie zunächst die Injektionsmischung mit 0,5 bis 12 Mikrogramm Plasmid pro Dosis vor. Bereiten Sie das entsprechende Volumen des Master-Mix für die Anzahl der Fische in der Gruppe vor.
Legen Sie die Kapillarnadel auf die klebrige Seite eines Bandstücks auf den entsprechenden Halter. Als nächstes Pipette Tröpfchen von Plasmid-Dosen auf ein Stück Laborfilm. Danach verwenden Sie eine Ladespitze, um die Plasmidtropfen aus dem Film in die Nadel zu übertragen.
Pipette langsam und vorsichtig, um zu vermeiden, Pipettier Luftblasen in die Nadel. Positionieren Sie den Mikromanipulator und eine Lichtquelle. Schalten Sie dann den Luftdruckhahn in die offene Position.
Stellen Sie die Pulslänge auf der Mikro-Injektor-Frontplatte im Zeitmodus auf 10 Sekunden ein. Dann stimmen Sie die Pulslänge mit dem 10-Turn-Periodenzifferblatt ab. Als nächstes stellen Sie die Nadel auf den Mikropipettenhalter des Mikromanipulators.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der Nadel zu schneiden, damit Flüssigkeit herausgeschoben werden kann, und verwenden Sie ein Mikroskop, um die Position der Nadel zu bewerten. Drücken Sie einmal den Fernfußschalter, um zu überprüfen, ob ein eins-Sekunden-Impuls ein kleines Tröpfchen aus der Nadel drückt. Passen Sie dann die Elektroporatoreinstellungen an und schließen Sie die Pinzette an den Elektroporator an.
Um den Fisch während der Injektion in einer festen Position zu halten, verwenden Sie ein Stück Schwamm mit einer Nut in der Mitte als Polsterung. Den Schwamm gründlich in Systemwasser einweichen und in eine Petrischale geben. Mit einem Plastiklöffel einen anästhesierten Zebrafisch in den nassen Schwamm mit der ventralen Seite des Fisches in die Nut geben.
Unter dem Mikroskop stellen Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel in der Nähe des Rückenmuskels des Zebrafisches, dann finden Sie den kleinen Fleck ohne Schuppen vor der Rückenflosse und drücken Sie die Nadel in den Muskel. Wenn Widerstand zu spüren ist, versuchen Sie es mit einer angrenzenden Stelle. Verwenden Sie den Fußschalter, um die Plasmidlösung nach und nach in den Muskel zu injizieren.
Unter dem Mikroskop sollte das Phenolrot sichtbar sein, wenn es in das Muskelgewebe gelangt. Elektroporate den Fisch unmittelbar nach der Injektion, indem die Elektroden vom Typ Pinzette an jeder Seite der Injektionsstelle platziert werden. Drücken Sie die Starttaste am Elektroporator und geben Sie ihm sechs 40-Volt-50-Millisekunden-Impulse.
Dann übertragen Sie die Fische vorsichtig in einen Erholungstank. Schließlich, nach der Anästheisisierung der Fische nach dem Textprotokoll, verwenden Sie ein UV-Licht, um EGFP-Expression in der Nähe der Injektionsstelle zu sehen. In diesem Protokoll wurden DNA-Antigene neben GFP im Expressionsvektor geklont.
Zebrafische wurden mit den DNA-Antigenplasmiden intramuskulär mit einem Mikroinjektor injiziert, und die Injektionsstelle wurde elektropoiert, um die Aufnahme von Plasmiden in die Zellen zu verbessern. Für die Bildgebung kann die Antigenexpression mit fluoreszenzmikroskopischer Mikroskopie visualisiert werden. In diesem Fall wurde die Expression aller drei Antigen-GFP-Fusionsproteine in der Nähe der Injektionsstelle nachgewiesen, obwohl ihre Intensität variierte.
Fünf Wochen nach der Immunisierung mit mykobakteriellen Antigenen wurden die Zebrafische mit Mycobacterium marinum infiziert. QPCR wurde verwendet, um die bakterielle Belastung in jedem Fisch vier Wochen nach der Infektion zu bestimmen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die mit Antigen eins immunisierten Fische nach einer Infektion mit M.marinum eine verminderte bakterielle Belastung.
Bei der Durchführung dieser Methode ist es wichtig, das Plasmidkonstrukt sorgfältig zu entwerfen, die Expression des Antigens zu validieren und die Injektionstechnik vor groß angelegten Experimenten zu praktizieren. Diese Technik kann den Weg für ein kostengünstiges präklinisches Screening neuartiger DNA-basierter Impfstoffkandidaten bei erwachsenen Zebrafischen ebnen. Vergessen Sie nicht, dass das Wohlergehen der Tiere sehr wichtig ist, und eine richtige Anästhesie ist bei der Durchführung dieses Verfahrens unerlässlich.
