Usamos este protocolo para procurar novos candidatos à vacina contra a tuberculose, mas posso ser aplicado a outras doenças infecciosas. Em comparação com os modelos de mamíferos, este método fornece um procedimento econômico para a triagem preliminar de novos candidatos à vacina baseada em DNA. Demonstrando o procedimento estará Hannaleena Piippo, uma técnica do nosso laboratório.
Para começar, coloque o capilar de vidro no sulco em V na barra polar e aperte levemente o botão de fixação. Mova o suporte ao lado do filamento e empurre suavemente o capilar através do filamento e para a barra polar do outro lado do filamento. Em seguida, aperte os botões de fixação, coloque o vidro de segurança e pressione o botão de puxar.
Depois disso, coloque as agulhas em um pedaço de adesivo reutilizável dentro de uma placa de Petri para proteger as pontas da agulha. Primeiro, prepare a mistura de injeção usando 0,5 a 12 microgramas de plasmídeo por dose. Prepare o volume adequado de mistura mestra para o número de peixes do grupo.
Coloque a agulha capilar no lado pegajoso de um pedaço de fita no suporte apropriado. Em seguida, gotículas de pipeta de doses de plasmídeos em um pedaço de filme de laboratório. Depois disso, use uma ponta de carregamento para transferir as gotas plasmidas do filme para a agulha.
Pipeta devagar e cuidadosamente para evitar tubos de ar bolhas na agulha. Posicione o micro manipulador e uma fonte de luz. Em seguida, troque a torneira de pressão de ar para a posição aberta.
No micro injetor do painel frontal ajuste o comprimento do pulso para 10 segundos usando o modo cronometrado. Em seguida, ajuste bem o comprimento do pulso com o mostrador do período de 10 voltas. Em seguida, coloque a agulha no suporte de micro pipeta do micro manipulador.
Use pinças para cortar a ponta da agulha para permitir que o líquido seja empurrado para fora, e use um microscópio para avaliar a posição da agulha. Pressione o interruptor remoto do pé uma vez para verificar se um pulso de um segundo empurra uma pequena gota para fora da agulha. Em seguida, ajuste as configurações do eletroporador e conecte as pinças ao eletroporador.
Para manter o peixe em posição fixa durante a injeção use um pedaço de esponja com um sulco cortado no meio como preenchimento. Mergulhe a esponja completamente na água do sistema e coloque-a em uma placa de Petri. Usando uma colher de plástico, transfira um zebrafish anestesiado para a esponja molhada com o lado ventral do peixe para baixo na ranhura.
Sob o microscópio coloque a agulha em um ângulo de 45 graus perto do músculo dorsal do zebrafish, em seguida, encontre o pequeno ponto sem escamas na frente da barbatana dorsal e empurre a agulha para dentro do músculo. Se alguma resistência for sentida, tente um local adjacente. Use o interruptor do pé para injetar gradualmente a solução plasmida no músculo.
Sob o microscópio, o vermelho fenol deve ser visível quando entra no tecido muscular. Eletroporar o peixe imediatamente após a injeção colocando os eletrodos do tipo pinça em cada lado do local da injeção. Pressione o botão de partida no eletroporador e dê-lhe seis pulsos de 40 volts de 50 milissegundos.
Em seguida, transfira suavemente o peixe para um tanque de recuperação. Finalmente, depois de anaethisizar o peixe de acordo com o protocolo de texto, use uma luz UV para ver a expressão EGFP perto do local da injeção. Neste protocolo, os antígenos de DNA foram clonados adjacentes ao GFP no vetor de expressão.
Zebrafish foram injetados com os plasmídeos de antígeno de DNA intramuscularmente com um micro injetor, e o local de injeção foi eletroporado para melhorar a ingestão de plasmídeos nas células. Para imagem, a expressão do antígeno pode ser visualizada com microscopia de fluorescência. Neste caso, a expressão das três proteínas de fusão de antígeno GFP foi detectada perto do local da injeção, embora sua intensidade variasse.
Cinco semanas após a imunização com antígenos micobacterianos, os zebrafish foram infectados com Mycobacterium marinum. O QPCR foi usado para determinar a carga bacteriana em cada peixe quatro semanas após a infecção. Em comparação com o grupo controle, os peixes imunizados com antígeno apresentaram diminuição das cargas bacterianas após infecção com M.marinum.
Ao executar este método é importante projetar o projeto plasmídeo cuidadosamente, validar a expressão do antígeno e praticar a técnica de injeção antes de experimentos em larga escala. Esta técnica pode abrir caminho para uma triagem pré-clínica econômica de novos candidatos à vacina baseada em DNA em zebrafish adultos. Não se esqueça que o bem-estar dos animais é muito importante, e a anestesia adequada é essencial durante a realização deste procedimento.
