Bu yöntem, mechanobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlayabilir, örneğin kuvvetler hücreler içinde ve hücreler arasında ve çevreleri arasında nasıl bulaştığı ve hissedildiği gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, proteinlerin canlı hücrenin doğal bağlamı içindeki mekanik kuvvetlere nasıl tepki verdiğine ilişkin moleküler ölçekli bilgilere erişim eve erişim sağlamasıdır. Bu yöntem özellikle fokal adezyon proteini vinkülinin incelenmesinde uygulanmış olsa da, talin, kadherin veya nesprin gibi diğer mekanik duyarlı proteinlere de uygulanabilir.
Uygun görüntüleme kurulumu zor ama analizin başarısı için gerekli olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Bu yordamı, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, istenilen hücre türünde gerilim sensörü yapısının kararlı bir şekilde ifade edilebilmektedir. Hücre tohumlama için substrathazırlamak için, dört 35 milimetre cam dipli yemekler elde.
Bir hücre kültürü başlık çalışma, bir 15 mililitre konik tüp, steril fosfat-tamponlu tuzlu çözeltisi mililitre fibronektin başına 10 mikrogram dört mililitre yapmak, veya PBS. Yavaşça bir kez karıştırmak için tüp ters ve çözelti hücre kültürü başlık beş dakika oturup sağlar. Sonra her cam dipli çanak üzerine fibronektin çözeltisi bir mililitre pipet.
Fibronektin çözeltisini oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede bir saat boyunca tabakların üzerine bırakın. Daha sonra fibronektin çözeltisini aspire edin ve PBS ile bir kez durulayın. Hücreler tohumlama için hazır olana kadar bulaşıklar üzerinde PBS bir mililitre bırakın.
Hücreleri sayarak sonra, tohum 30, 000 hücreleri her fibronectin kaplı cam çanak üzerine 1.5 mililitre son hacmi için uygun tam medya ile. Hücrelerin tohumlamadan sonra dört saat boyunca yayılmasını bekleyin. Yayılan iki saat, büyüme medya aspire ve görüntüleme medya ile bir kez durular.
1,5 mililitre görüntüleme ortamı bırakın. Kalibrasyona başlamadan önce metin protokolünde açıklandığı gibi mikroskobu ısıtın. FRAP lazerini kalibre etmek için önce lazer yapılandırma penceresini açın.
Aydınlatma ayarını, örneğe lazerle maruz kalmak için uygun FRAP Aydınlatma ayarlarına ayarlayın. Daha sonra Aydınlatma ayarını yalnızca kabul eden floroforgörüntüleme için uygun aydınlatma ayarlarına ayarlayın. Koordinat sistemi ayarı altında kalibre etmek için hedefi seçin.
İşareti Tek le kalibrasyon noktalarına tıklayın ve kalibrasyon sırasında Görüntüle görüntüleri kontrol edin. Dwell süresini 10,000 mikrosaniyeye, darbe sayısını da 100'e ayarlayın. Şimdi bir cam slayt ve bir kapak kayma arasında mühürlü ethidium bromür yapılmış kalibrasyon slayt, kapak kayma tarafı aşağı ile sahne adaptörü içine yerleştirin.
En parlak sinyale sahip odak düzlemi olarak tanımlanabilir olan slayt yüzeyine odaklanmak için kabul eden aydınlatma ayarlarını kullanın. Kaplamadaki küçük kusurlar odaklamada yardımcı olacak şekilde görülebilir. Slaytı görüntüleme düzlemi boyunca tek düze floresan içeren bir alana taşıyın.
Sonraki kalibrasyonlar için ilk kalibrasyon veya Güncelleştirme Ayarı için Ayar Oluştur'a tıklayın. Yazılım otomatik olarak ağartma ve ağartılmış noktanın konumunu tespit, kalibrasyon süreci başlattı. Eşit olarak dağıtılması ve odaklanması gereken ağartılmış noktaların üçe üç ızgarası olacak son görüntüyü değerlendirerek başarılı bir kalibrasyon sağlayın.
Kalibrasyon görüntüsünü gelecekteki başvuruiçin kaydedin. Kalibrasyon kaydırağını çıkarın ve güvenli bir şekilde saklayın. Kalibrasyon her denemeye başlamadan önce yapılmalıdır, ancak numuneler arasında yapılması gerekmez.
Canlı hücre görüntüleme için mikroskop kurulum hazırlayın, tercihen ısıtmalı bir sahne ve objektif, yanı sıra bir karbondioksit kontrolü ile. 20 dakika boyunca dengede bekleyin. Şimdi, gerilim sensörünü ifade eden oluşturulan hücre örneklerinden birini görüntüleme için mikroskop tutucuya yerleştirin.
Hücrelerin 10 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin. Görüntüdeki hücrelerin sağlığını sağlamak için, görüntüleme odasında sıcaklığı 37 santigrat derecede koruyun. PH korumak için dakikada 15 mililitre de numuneler üzerinde nemlendirilmiş% 5 karbondioksit geçmek için bir peristaltik pompa kullanın.
Çok Boyutlu Edinme veya MDA aracını açın ve farklı filtre kümeleri de dahil olmak üzere FRET görüntüleme parametreleri ile ayarlayın. Bu MDA'yı MDA_FRET_date adında ki Deneysel Klasöre kaydedin. Farklı filtre setleri, Timelapse ayarları ve dergi de dahil olmak üzere FRAP görüntüleme parametreleri ile başka bir MDA ayarlayın ön çamaşır suyu edinimi nden sonra lazer darbe.
Bu MDA'yı MDA_FRAP_date adındaki Deneysel Klasöre kaydedin. Ekranın üst kısmındaki araç çubuğunda Journal, Start Recording'i seçin. MDA penceresini açın, MDA_FRET_date durumunu yükleyin ve Edinme'ye basın.
Daha sonra MDA_FRAP_date durumunu yükleyin ve Acquire tuşuna basın. Satın alma sonunda, ekranın üst kısmındaki araç çubuğunda Journal, Stop Recording'i seçin. Bu Günlüğü FRETFRAP_date adıyla Deneysel Klasöre kaydedin ve kolay erişim için bir araç çubuğuna ekleyin.
MDA penceresini kapatın. İlgi hücrelerini tanımlamak için en az pozlama süresi ve nötr yoğunluk filtresi ile Edinme, Edinme altındaki görüntü edinimi kullanarak örnekte gezinin. Cihazlara, Focus'a yön vererek sürekli otomatik netleme ayarlayın.
Doğru görüntüleme düzlemine ulaşana kadar numuneye manuel olarak odaklanın. Sürekli Netle'yi ayarla'yı tıklatın ve sistemin ayarlanmasını bekleyin. Sistem ayarlandıktan sonra Sürekli Netle'yi Başlat'ı tıklatın.
Daha sonra gerilim sensörünü açık yerelleştirme ile bir cep telefonu bulun ve görüntüyü çekin. Ağartıcının nerede olduğunu vurgulamak için dikdörtgen bir ilgi alanı veya YG çizin. Bu YG konumunu saklayın.
Şimdi FRET görüntülerinin edinimi başlayacak FRETFRAP_date dergi, FRAP timelapse başlatılması ardından başlatın. 10 ila 15 görüntü kümesi elde edilene kadar bu adımları yineleyin. Ardından FRET-FRAP verilerini metin protokolünde ayrıntılı olarak analiz edin.
Burada gösterilen vinkülin gerilim sensörü FRET görüntüleme için temsili sonuçlar, segmentasyon ve fokal yapışıklıkları izole etmek için maskeleme aşağıdaki. Vinkülin yükünün aralıklı varyasyonu hücre boyunca görülebilir. FRAP görüntüleme ve analizi odak yapışma stabilitesi etkilenebilir.
Görüntüleme döneminde hızla yer değiştirebilen bir odak adezyonu doğru bir şekilde takip etmek zor olabilir. Genellikle bu süreksizlikler içeren ve yorumlanabilir bir FRAP eğrisi ile gösterilir. Yabani bir vinkülin için, protein yükü ile ciro oranı arasında ters bir korelasyon vardır, bu da vinkülin incisi olduğunu gösterir.
Bağın bağlanmasını etkilemek için vinkülin bir mutasyonuyguluyor olması, talini bağlayamayan vinkülin kuvvetle dengesini bozduğuna işaret ediyor. Bu yordamı denerken, örnekleri doğru şekilde hazırlamayı, hücrelerin sensörü endojen seviyelerde ifade etmesini sağlamayı ve görüntüleme parametrelerini dikkatle seçmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, immünoresans gibi diğer yöntemler, hücresel ölçek dinamikleri veya çeşitli inhibitörleri ile zorlu hücreleri ölçme ilgi proteini kuvvet eve yanıtı koordine etmek için diğer hücre altı bileşenleri ile etkileşim gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir.
