Bu insancıl fare modeli nin oluşturulması klinik öncesi HIV araştırma çalışmalarına yardımcı olabilir. Örneğin, hem farklı viral suşları ve yeni HIV müdahaleleri değerlendirilebilir. Bu protokoller kök hücre donörü CCR5 varyant durumunu değerlendirmek ve insanlaşmış farelere HIV bulaştırmak ve fare plazmaviral yüklerini ölçmek için kullanılabilir.
RNA niceleme protokolü, plazma örneklerinde saptanabilen herhangi bir viral RNA dizisini ölçmek için kolayca uyarlanabilir. CCR5 delta 32 varyantları için kordon kanı örneklerinin genetik taraması için, 200 mikromolar dNTP karışımı içeren 11,25 mikrolitre PCR karışımı, yüksek sadakatli DNA polimeraz mikrolitre başına 0,01 birim ve tabloda ayrıntılı olarak ileri ve ters astarlar ile 1.25 mikrolitre peletli olmayan akış inkübat. Çekirdeğiz su ile hacmi her PCR reaksiyonu için yaklaşık 12,5 mikrolitreye ayarlayın ve tabloda belirtildiği gibi PCR bisiklet programı ile genomik parçaları yükseltin.
Reaksiyonun sonunda, PCR ürünlerini %2 agarose jel üzerinde ayırın. Yabani tip alellerden ve delta 32 alelden pcr ürünleri sırasıyla 196 baz çifti ve 164 baz çiftinin PCR parçalarını verimleyerek bantları jel elektroforez ile kolayca ayırt edilebilir hale getirir. Intravajinal HIV maruziyeti için, farenin bulunacağı çalışma alanının merkezine odaklanmış bir ısıtma lambası yerleştirin ve kaputun içine uygun bir pipet içine steril 20 mikrolitrelik pipet uçları yerleştirin.
Virüs le temas etmiş herhangi bir malzeme ve sıvıhemen aktivasyonu için kaputiçine sıvı dezenfektan ile bir konteyner yerleştirin. Anestezili fareyi, kapağın arkasına bakan farenin kuyruğuyla lambanın altındaki supine pozisyonunda steril mavi bir pedin üzerine yerleştirin ve faredeki pedal refleksine yanıt eksikliğini onaylayın. Kuyruğun dibinde hayvan kavramak.
Fareyi kuyruk tabanından yavaşça kaldırarak, hayvanı baş aşağı dik pozisyonda destekleyin. Rektumun boşaltımına neden olmak ve vajina üzerindeki baskıyı hafifletmek için anüse doğru hafifçe okşayarak genital bölgeyi uyarmak için steril bir boru ucu kullanın. Vajinal açıklığı ortaya çıkarmak için fare kuyruğunu dikkatlice parmakların üzerinde sarın, vulva doğal olarak açılır.
Yeni bir pipet ucu kullanarak, vajinal açılış düzeyinde ucu yerleştirin ve atravmatik vajina içine virüsün 20 mikrolitre serbest, yerçekimi vajina içine viral süspansiyon çekmek için izin. Tüm virüs teslim edildiğinde, virüsün yerçekimine bağlı sızıntısını önlemek için fareyi bu pozisyonda beş dakika tutun. Daha sonra fareyi dikkatlice supine pozisyonundaki ev kafesine geri döndürün ve tam iyileşme yenekadar izleyin.
Çözülmüş fare plazma örneklerinden RNA'yı izole etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir virüs RNA izolasyon kiti kullanın. Sütuna bağlanan örneği ekleyin ve plazma numunesindeki tüm DNA'nın çıkarılmasını sağlamak için sütun üzerine bir DNase tedavi adımı ekleyin. Daha sonra RNA örneklerini en az bir saat boyunca 80 derecede saklayın.
CDNA sentezlemek için, rdna bozulmasını önlemek için cDNA reaksiyonu içinde bir RNase inhibitörü0.5 mikrolitre de dahil olmak üzere standart protokollere göre ters transkriptaz kullanın, sonra tabloda ayrıntılı olarak cDNA sentezi yapmak ve en az bir saat için 80 santigrat derece cDNA örnekleri saklamak. DdPCR için numune hazırlamak için, polimeraz ve dNTPs içeren 11 mikrolitre ddPCR prob reaksiyon karışımını, tabloda belirtildiği gibi, küçük oluk bağlama probundan 250 nanomolar ve ileri ve geri astarların her birinin 900 nanomolar'ı ile karıştırın. Her cDNA örneğinden üç mikrolitre ekleyin ve toplam PCR hacimlerini çekirdeksiz suyla 22 mikrolitreye ayarlayın.
PCR karışımlarını emülsifiye etmek için üreticinin protokolüne göre bir damlacık jeneratör probları için damlacık üretimi yağı kullanın. Ardından, tabloda belirtildiği gibi PCR programını çalıştırın. Doğrulanmış HIV enfeksiyonu sonrası cART tedavisi için, fareleri tabloda belirtildiği gibi standart bir cART rejimi içeren harici bir satıcı tarafından hazırlanan peletlerle besleyin.
Kolayca sıradan fare chow ayırt etmek ve standart kahverengi renk te cART olmadan bir kontrol chow diyet kullanmak için kırmızı renkli cART diyet kullanın. Tedavinin başlatılması için, fareleri eski kafesten yeni kafese aktarmadan önce cART içeren chow diyetini steril kafeslere yerleştirin. Daha sonra farelerin ağırlıklarını izleyin ve farelerin değişime uyum sağladığından emin olmak için her gün cART içeren chow tüketimini kontrol edin.
Burada, kök hücre saflığının analizi için akış sitometri sitometri sitometri sitasyon stratejisi, izole CD34 pozitif kök hücrelerin saflığı genellikle % 85 ila%95 arasında değişen ve %1'den az T hücre kontaminasyonu ile betimlenmiştir. PCR analizi saflaştırılmış donör kök hücrelerin CCR5 varyant durumunu göstermektedir, CCR5 delta 32 heterozigot donörler kolayca tanımlanabilir hale. 19 donörden oluşan bir grupta mutant genotip sıklığı İskandinav popülasyonlarının daha büyük epidemiyolojik çalışmaları ile uyum içinde yaklaşık% 15.8 idi.
Alıcı fareleriçine 7.5 kez 10 10 adoptive transferi üç ila beş ay sonra, alıcı hayvan periferik kan örneklerinden elde edilen beyaz kan hücrelerinin% 20-50 insan CD45 pozitif hücreler ve fareler insan B ve T hücreleri gelişmiş olacak. Farelerin%64'ü gösterildiği gibi vajinal maruziyet sonrasında HIV ile enfekte olur. Standart cART içeren 40 günlük bir diyete geçtikten dört hafta sonra, HIV pozitif farelerdeki viral yükler algılama sınırının altına düşer.
Diyetin kesilmesinden sonra virüs rebound, klinik verileri yansıtan. Daha da önemlisi, cART fareler iyi diyet değişikliği tolere. Bu hayvanların bağışıklık eksikliği ve bu nedenle çevreye karşı savunmasız olduğunu hatırlamak çok önemlidir.
Aseptik tekniklere bağlı kalmak genel hayvan sağlığını ve protokol başarısını artıracaktır. HIV enfeksiyonu için insanlaşmış fare kohortunun kurulmasından sonra, protokol dokularda viral RNA nicelleştirme veya farklı viral suşlarda yeni müdahalelerin test edilmesi için uyarlanabilir. HIV enfeksiyonu çalışmaları için insanlaşmış farelerin esnekliği ve erişilebilirliği HIV virolojisi, immünoloji ve tedavi araştırmalarında kritik ilerlemeyi sağlamıştır.
Bulaşıcı HIV içeren protokolleri denemeden önce, yerel çalışma ortamı yetkililerinden onay aldığından ve onaylı dekontaminasyon prosedürlerine uyduktan emin olun.
