내과 성 망상은 지속적으로 세포 골격과 상호 작용하는 동적 관 도메인이 일정한 움직임과 재배열을 겪는다. ER이 이 조직을 생성하고 유지하는 방법은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 여기서 우리는 복잡한 지질 나노튜브 네트워크로 옮겨질 수 있는 고체 지원 단백질 없는 멤브레인 시스템으로 구성된 ER용 상향식 구조 세포지 모델을 형성하는 편리한 물질을 제시한다.
친수성 유수 의 화합물은 에너지를 위한 유기 화합물. 단백질 정제 및 단백질 추출은 필요하지 않습니다. 유일한 필수 구성 요소는 가장 기본적인 ER 모델을 제공하는 고체 기판 및 인지질입니다.
용존 지질 용액을 10 밀리리터 반전 배 모양플라스크로 옮기면 총 3, 000 마이크로그램의 지질과 300 마이크로리터의 엽록소를 추가합니다. 그런 다음 플라스크를 회전 증발기에 연결하고 45도 기울기로 배치합니다. 24 RPM에서 수조 내부의 플라스크를 6시간 동안 섭씨 23도에서 회전하여 공기 압력이 감소하여 클로로폼을 천천히 완전히 제거합니다.
압력이 20킬로파스칼에 도달할 때까지 2분마다 20킬로파스칼의 단계로 회전을 시작한 직후 압력을 줄이기 시작합니다. 6시간 후, 회전을 멈추고 100킬로파스칼에 도달할 때까지 2분마다 20킬로파스칼의 단계로 서서히 공기 압력을 증가시다. 회전 증발기에서 플라스크를 제거하고 PBS의 3 밀리리터와 글리세롤 30 마이크로 리터를 추가합니다.
플라스크를 부드럽게 소용돌이치면 글리세롤을 녹입니다. 통풍이 꽉 찬 유리 스토퍼를 사용하여 지질이 들어있는 플라스크를 밀봉하십시오. 지질 필름의 재수화와 붓기를 위해 밤새 냉장고에 플라스크를 섭씨 4도에 보관하십시오.
다음 날, 실온에서 초음파 수조와 35 킬로 헤르츠 주파수에서 지질을 초음파 처리하여 균일한 약간 탁한 지질 현탁액을 달성하십시오. 초음파 처리는 약 10~30초가 걸릴 수 있습니다. 장기간 초음파 처리는 열을 생성하고 vesical 형성에 해롭습니다.
이러한 단계는 두 가지 유형의 vesicular 구조를 포함하는 현탁액을 생성합니다. 다발성 멜라 소포와 거대한 유니라멜라 소포. 보관을 위해 지질 현탁액을 총 30마이크로센트심립지 튜브를 사용하여 100개의 마이크로리터 알리코크로 나눕니다.
알리코를 영하 20도의 냉동고에 보관합니다. 액체 질소로 플래시 동결이 필요하지 않습니다. 지질 현탁액을 해동하고 깨끗한 유리 현미경 슬라이드 또는 커버 슬립에 서스펜션의 네 마이크로 리터 액자를 전송합니다.
20분간의 건조 후, 액적들은 눈에 보이는 지질의 평평한 원형 필름으로 붕괴됩니다. 3 분 동안 HEPES 버퍼의 1 밀리리터로 지질 필름을 다시 수분. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 ER 변환을 시작하는 데 필요한 자동 파이펫을 통해 버퍼 교환을 허용하도록 열린 상단으로 관측 챔버를 준비합니다.
주걱으로 경화 된 PDMS 슬래브를 제거 한 후 메스를 사용하여 프레임을 현미경 단계에서 사용 가능한 개구부에 적합한 치수 및 형상으로 자른다. 1.5 x 1.5 x 0.5센티미터의 치수는 대부분의 설정에 적합합니다. 알루미늄 산화물 필름이 있는 표면의 활성 면과 접촉하도록 PDMS 프레임의 매끄러운 면을 가져와서 프레임을 서로 밀어 붙이도록 압력을 부드럽게 가집니다.
즉시 칼슘 HEPES 버퍼로 관측실을 채웁니다. 후속 단계에서 재수화 된 지질을 첨가 할 수 있도록 전체 챔버 볼륨을 채우지 마십시오. 공초점 현미경 단계에 챔버를 놓습니다.
거대한 소포가 들어있는 현탁액인 수분화 된 지질 물질을 플라스틱 목초지 파이펫으로 챔버로 옮킨다. 10-20분 동안 기다린 후 소포가 기판에 부착되어 표면을 가로질러 퍼질 수 있습니다. 확산은 표면에 지질의 증착 직후에 시작됩니다.
지질이 확산되기 전에 버퍼 교환은 표면의 지질 구조를 가능한 한 빨리 제거하거나 신속하게 첨가해야 한다. 여러 지질 스프레드를 관찰한 후 자동 파이펫을 통해 주변 버퍼를 천천히 제거합니다. 따라서 얇은 버퍼 필름만 바닥에 남아 있습니다.
신속한 제거를 피하기 위해 주의하십시오. 자동 파이펫을 사용하여 셀라토르 HEPES 버퍼로 관측챔버를 천천히 채우면 주변 버퍼 교환으로 진행한다. 갑작스러운 추가를 피하십시오.
마지막 단계는 다각형 소포에 DLBM의 분해 및 철회 유도의 결과로 형성된 동적 나노관형 네트워크를 산출합니다. 여기에 프로토콜에서 얻은 나노튜브 네트워크의 현미경 그래프가 나와 있다. 이 이미지에서 연속 밝은 빨간색 영역은 파란색 파선으로 표시된 DLBM의 후퇴 부분입니다.
여기에 표시, 대비를 높이기 위해 반전 된 관 네트워크의 현미경 그래프입니다. 여기서, 관 밀도의 감소는 3시간 20분 동안 멤브레인 영역에 도시된다. 관 밀도의 감소는 표면에서 DLBM의 후퇴 뒤에 점진적인 디핀으로 인해 발생합니다.
칼슘 매개 고정 점의 위치는 튜브가 단말 또는 날카로운 회전을 갖는 지점으로 확립 될 수있다. 날카로운 회전은 튜브 정렬의 방향이 급격히 이동하기 때문에 v 접합또는 전환점이라고합니다. 끝점은 튜브가 후퇴하는 것을 방지하는 튜브의 종단을 나타냅니다.
확산이 장기간 계속되면 막 장력이 증가하여 파열됩니다. 지질은 형광으로 표시되기 때문에, 파열은 직접 관찰 될 수있다. 파열의 주요 지표는 파열 된 지역에서 형광 강도의 상당한 하락이다.
샘플의 완전한 탈수 또는 버퍼의 빠른 교환은 패치의 방해, 파열 또는 변형을 유발합니다. 모델의 복잡성은 지질 단백질과 같은 ER 관련 성분을 추가하여 구축될 수 있다. 그리고 이 모형은 또한 자기 조립, 나노 유체학, 마랑고니 흐름 및 수송 현상을 연구하기 위하여 암시될 수 있습니다.
클로로폼은 독성이 높고 휘발성이 매우 높으며 항상 연기 후드와 폴리 비닐 아세테이트 실험실 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경을 포함한 관련 개인 보호 장비로 취급해야합니다.
