Эндоплазмический цитокулум содержит динамический трубчатый домен, который постоянно взаимодействует с цитоскелетом, подвергается постоянному движению и перестановке. Как ER генерирует и поддерживает эту организацию, пока не до конца понятно. Здесь мы представляем удобный вопрос для формирования снизу вверх структурной модели органеллы для ER, которая состоит из твердо поддерживается без белка мембранной системы, которые могут быть переданы в сложные сети липидных нанотрубок.
Гидрофилия является органическим соединением для получения энергии. Очистка белка и экстракция белка не требуются. Единственными важными компонентами являются твердый субстрат и фосфолипиды, обеспечивающие наиболее базовую модель ER.
Перенесите растворенные липидные растворы в 10 миллилитровую перевернутую колбу грушевидной формы, добавляя в общей сложности 3000 микрограммов липидов и 300 микролитров хлороформа. Затем соедините колбу с вращающимся испарителем и располагайте ее наклоном 45 градусов. Поверните колбу при 24 об/мин в водяной бане при 23 градусах По Цельсию в течение шести часов с пониженным давлением воздуха, чтобы медленно и полностью удалить хлороформ.
Начните снижать давление сразу после начала вращения шагами по 20 килопаскаль каждые две минуты, пока давление не достигнет 20 килопаскаль. Через шесть часов, остановить вращение и увеличить давление воздуха снова постепенно шагами 20 килопаскалей каждые две минуты до достижения 100 килопаскалей. Снимите колбу с роторного испарителя и добавьте три миллилитров PBS и 30 микролитров глицерола.
Аккуратно закружить колбу, чтобы растворить глицерол. Используйте герметивую стеклянную пробку, чтобы запечатать колбу, содержащую липиды. Храните колбу в холодильнике при четырех градусах Цельсия на ночь для регидратации и отек липидных пленок.
На следующий день, sonicate липидов с ультразвуковой водяной бане при комнатной температуре и при частоте 35 килогерц до достижения равномерной слегка мутной липидной суспензии. Sonication может занять от 10 до 30 секунд. Длительное звуковое воздействие производит тепло и вредно для везикулярного образования.
Эти шаги дают подвеску, содержащую два типа везикулярных структур. Multilamellar пузырьки и гигантские unilamellar пузырьки. Для хранения разделите липидную суспензию на 100 микролитровых алицитов, используя в общей сложности 30 микроцентрифугных трубок.
Храните алициты в морозильной камере при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Внезапная заморозка жидким азотом не требуется. Оттепель липидной подвески и передачи четырех микролитер капли подвески на чистый стеклянный микроскоп слайд или крышка скольжения.
Через 20 минут высыхания капля рухнет в плоскую круговую пленку липидов, которая видна глазу. Увлажнить липидную пленку одним миллилитром буфера HEPES в течение 3 минут. Подготовьте камеру наблюдения с открытым верхом, чтобы обеспечить буферный обмен с помощью автоматической пипетки, которая необходима для инициирования преобразования ER, подробно описанного в текстовом протоколе.
После удаления вылеченной плиты PDMS шпателем используйте скальпель, чтобы разрезать раму на размеры и геометрию, подходящие для доступного отверстия на стадии микроскопа. Размеры 1,5 на 1,5 на 0,5 сантиметра подходят для большинства установок. Принесите гладкую сторону рамы PDMS в контакт с активной стороной поверхности, где находится пленка оксида алюминия и осторожно применить давление, чтобы подтолкнуть раму и поверхность друг против друга, чтобы заставить их придерживаться.
Немедленно заполните камеру наблюдения буфером HEPES кальция. Не заполняйте весь объем камеры, чтобы обеспечить добавление регидратированных липидов в последующий шаг. Поместите камеру на стадию конфокального микроскопа.
Перенесите регидратированный липидный материал, теперь подвеску, содержащую гигантские пузырьки, в камеру с пластиковой пипеткой пастбища. Подождите от 10 до 20 минут, чтобы пузырьки прилипли к подложку и распространились по всей поверхности. Распространение начинается сразу после осаждения липидов на поверхности.
Перед распространением липидов структура буферного обмена должна быть сделана как можно мягче быстрое удаление или быстрое добавление буфера возмущает липидные структуры на поверхности. После наблюдения нескольких липидных спредов, медленно удалить окружающий буфер с помощью автоматической пипетки. Так что на дне остается только тонкая буферная пленка.
Позаботьтесь, чтобы избежать быстрого удаления. Приступайте к обмену буфера окружающей среды, медленно заполняя камеру наблюдения буфером chelator HEPES с помощью автоматической пипетки. Избегайте резкого добавления.
Заключительный шаг дает динамические нанотубубные сети, образованные в результате хелатора индуцированного выкования и опрокидывания DLBM к многоламерным пузырькам. Здесь показаны микрографы сетей нанотрубок, полученные в протоколе. На этом изображении непрерывные ярко-красные области являются убирая долей DLBM, которая отмечена синей пунктирной линией.
Здесь показан микрограф трубчатой сети, перевернутой для увеличения контрастности. Здесь снижение трубчатой плотности отображается на мембранной области в течение трех часов и 20 минут. Уменьшение трубчатой плотности происходит из-за постепенного депинирования с последующим опрокидыванием DLBM с поверхности.
Расположение кальция опосредовано точки закрепления могут быть установлены в качестве точек, где трубы имеют терминал или резкие повороты. Острые повороты называются v соединениями или поворотными точками из-за внезапного сдвига в направлении выравнивания труб. Конечной точкой представляет собой конечной части трубки, которая предотвращает трубку от опрокидывания.
Если распространение продолжается в течение длительных периодов времени, мембрана увеличивается, что приводит к разрывам. Так как липиды флуоресцентно помечены, разрыв может быть непосредственно наблюдается. Ключевым показателем разрыва является значительное снижение интенсивности флуоресценции в разорванном регионе.
Полное обезвоживание образца или быстрый обмен буферами вызывает нарушение, разрыв или деформацию патчей. Сложность модели может быть создана путем добавления ER связанных компонентов, таких как липидные белки. Эта модель также может быть подразумеваема для изучения самосъемки, нанофлюиды, потока марангони и транспортных явлений.
Хлороформ является токсичным и высоко летучих она всегда должна быть обработана под капотом дыма и с сопутствующим личным защитным оборудованием, включая поливинил ацетат лабораторные перчатки, лабораторное пальто, и защитные очки.
