O ânticulo endoplasmático contém um domínio tubular dinâmico que interage continuamente com o citoesqueleto sofre movimento e rearranjo constantes. Como o ER gera e mantém essa organização ainda não é totalmente compreendida. Aqui apresentamos uma matéria conveniente para formar um modelo de organela estrutural de baixo para cima para o ER, que consiste em um sistema de membrana livre de proteínas de suporte sólido que pode ser transferido para redes complexas de nanotubos lipídicos.
Hidrofílico é um composto orgânico para energia. A purificação de proteínas e a extração de proteínas não são necessárias. Os únicos componentes essenciais são o substrato sólido e os fosfolipídios que fornecem o modelo er mais básico.
Transfira as soluções lipídicas dissolvidas em um frasco invertido em forma de pera invertido de 10 mililitros, somando uma quantidade total de 3.000 microgramas de lipídios e 300 microlitadores de clorofórmio. Em seguida, conecte o frasco a um evaporador rotativo e posicione-o com uma inclinação de 45 graus. Gire o frasco a 24 RPM dentro de um banho de água a 23 graus Celsius por seis horas com pressão de ar reduzida para remover lentamente e completamente o clorofórmio.
Comece a reduzir a pressão logo após iniciar a rotação por passos de 20 quilopascals a cada dois minutos até que a pressão atinja 20 quilopascals. Após seis horas, pare a rotação e aumente a pressão do ar novamente gradualmente por passos de 20 quilopascals a cada dois minutos até atingir 100 quilopascals. Remova o frasco do evaporador rotativo e adicione três mililitros de PBS e 30 microliters de glicerol.
Gire suavemente o frasco para dissolver o glicerol. Use uma rolha de vidro apertada para selar o frasco contendo os lipídios. Armazene o frasco na geladeira a quatro graus Celsius durante a noite para reidratação e inchaço dos filmes lipídes.
No dia seguinte, sonicar os lipídios com um banho de água ultrassônico à temperatura ambiente e a 35 quilohertz frequência até conseguir uma suspensão lipídica uniforme ligeiramente turva. A sônica pode levar em torno de 10 a 30 segundos. A sônica prolongada produz calor e é prejudicial à formação vesical.
Estas etapas produzem uma suspensão contendo dois tipos de estruturas vesiculares. Vesículas multilamellar e vesículas unilamellar gigantes. Para armazenamento, divida a suspensão lipídica em 100 alíquotas de microliter usando um total de 30 tubos de microcentrifusagem.
Guarde as alíquotas em um congelador a menos 20 graus Celsius. O congelamento de flash com nitrogênio líquido não é necessário. Descongele a suspensão lipídica e transfira uma gotícula de quatro microliter de suspensão para um deslizamento de microscópio de vidro limpo ou deslizamento de cobertura.
Após 20 minutos de dessecação, a gota entrará em colapso em uma película circular plana de lipídios que é visível aos olhos. Reidratar o filme lipíduo com um mililitro de tampão HEPES por 3 minutos. Prepare a câmara de observação com uma parte superior aberta para permitir a troca de buffer por meio de uma pipeta automática, que é necessária para iniciar a transformação do ER conforme detalhado no protocolo de texto.
Depois de remover a laje PDMS curada com uma espátula, use um bisturi para cortar o quadro nas dimensões e geometria apropriadas para a abertura disponível no estágio do microscópio. Dimensões de 1,5 por 1,5 por 0,5 centímetros são adequadas para a maioria das configurações. Coloque o lado liso do quadro PDMS em contato com o lado ativo da superfície onde reside a filme de óxido de alumínio e aplique suavemente pressão para empurrar a estrutura e a superfície uns contra os outros para fazê-los aderir.
Preencha imediatamente a câmara de observação com tampão HEPES de cálcio. Não encha todo o volume da câmara para permitir a adição dos lipídios rehidratados na etapa subsequente. Coloque a câmara no estágio do microscópio confocal.
Transfira o material lipídudo rehidratado, agora uma suspensão contendo vesículas gigantes, para a câmara com uma pipeta de pastagem de plástico. Espere de 10 a 20 minutos para deixar as vesículas aderirem ao substrato e se espalharem pela superfície. A propagação começa imediatamente após a deposição de lipídios na superfície.
Antes que o lipídio se espalhe pela estrutura, a troca de tampão deve ser feita da forma mais suave possível de remoção rápida ou a adição rápida do tampão perturba as estruturas lipídicas na superfície. Depois de observar múltiplos diágidos lipídes, remova lentamente o tampão ambiente através de pipeta automática. De tal forma que apenas uma fina película tampão permanece na parte inferior.
Tome cuidado para evitar uma remoção rápida. Proceda para a troca de tampão ambiente preenchendo lentamente a câmara de observação com tampão HEPES querador usando uma pipeta automática. Evite adição abrupta.
A etapa final produz redes nanotubulares dinâmicas formadas como resultado da depinning induzida pelo chelator e retração do DLBM para as vesículas multilamellar. Aqui são mostrados micrografos das redes de nanotubos obtidos no protocolo. Nesta imagem, as regiões vermelhas vivas contínuas são a fração retraída do DLBM, que é marcado com uma linha azul tracejada.
Mostrado aqui, é um micrografo de uma rede tubular que foi invertida para aumentar o contraste. Aqui, a redução da densidade tubular é mostrada em uma região de membrana ao longo de três horas e 20 minutos. A diminuição da densidade tubular ocorre devido ao depinning gradual seguido pela retração do DLBM da superfície.
Os locais dos pontos de fixação mediados pelo cálcio podem ser estabelecidos como os pontos onde os tubos têm curvas terminais ou afiadas. Curvas nítidas são referidas como junções v ou pontos de giro devido à mudança repentina na direção do alinhamento dos tubos. O ponto final representa o cupino do tubo que impede a retração do tubo.
Se a propagação continuar por períodos prolongados, a tensão da membrana aumenta levando a rupturas. Uma vez que os lipídios são fluorescentes rotulados, a ruptura pode ser observada diretamente. Um indicador-chave de ruptura é a queda significativa da intensidade da fluorescência na região rompida.
Uma desidratação completa da amostra ou troca rápida de tampões causa perturbação, ruptura ou deformação das manchas. A complexidade do modelo pode ser construída adicionando componentes associados ao ER, como proteínas lipídicas. E este modelo também pode estar implícito para estudar fenômenos de auto-montagem, nanofluidos, fluxo de marangoni e transporte.
O clorofórmio é tóxico e altamente volátil deve ser sempre manuseado sob um capô de fumaça e com equipamentos de proteção pessoal associados, incluindo luvas de laboratório de acetato de polivinil, jaleco e óculos de segurança.
