Il reticolo endoplasmatico contiene un dominio tubolare dinamico che interagisce continuamente con il citoscheletro subisce un movimento costante e un riarrangiamento. Il modo in cui il pronto accordo genera e mantiene questa organizzazione non è ancora pienamente compreso. Qui presentiamo una questione conveniente per formare un modello di organello strutturale dal basso verso l'alto per l'ER, che consiste in un sistema di membrana privo di proteine supportato da solidi che può essere trasferito a complesse reti di nanotubi lipidici.
L'idrofilia è un composto organico per l'energia. La purificazione proteica e l'estrazione delle proteine non sono necessarie. Gli unici componenti essenziali sono il substrato solido e i fosfolipidi che forniscono il modello ER più semplice.
Trasferire le soluzioni lipidiche disciolte in un pallone a forma di pera rovesciata da 10 millilitri che aggiunge fino a una quantità totale di 3.000 microgrammi di lipidi e 300 microlitri di cloroformio. Quindi collegare il pallone a un evaporatore rotante e posizionarlo con un'inclinazione di 45 gradi. Ruotare il pallone a 24 giri/min all'interno di un bagno d'acqua a 23 gradi Celsius per sei ore con una pressione dell'aria ridotta per rimuovere lentamente e completamente il cloroformio.
Iniziare a ridurre la pressione subito dopo aver avviato la rotazione di gradini di 20 kilopascal ogni due minuti fino a quando la pressione raggiunge i 20 kilopascal. Dopo sei ore, interrompere la rotazione e aumentare nuovamente la pressione dell'aria gradualmente di gradini di 20 kilopascal ogni due minuti fino a raggiungere i 100 kilopascal. Rimuovere il pallone dall'evaporatore rotante e aggiungere tre millilitri di PBS e 30 microlitri di glicerolo.
Ruotare delicatamente il pallone per sciogliere il glicerolo. Utilizzare un tappo di vetro ermetica per sigillare il pallone contenente i lipidi. Conservare il pallone in frigorifero a quattro gradi Celsius durante la notte per la reidratazione e il gonfiore delle pellicole lipidiche.
Il giorno seguente, sonicare i lipidi con un bagno d'acqua ad ultrasuoni a temperatura ambiente e a 35 kilohertz di frequenza fino a ottenere una sospensione lipidica uniforme leggermente torbida. La sonicazione può richiedere dai 10 ai 30 secondi. La sonicazione prolungata produce calore ed è dannosa per la formazione vesica.
Questi passaggi producono una sospensione contenente due tipi di strutture vescicolari. Vescicole multilamellari e vescicole unilamellari giganti. Per lo stoccaggio, dividere la sospensione lipidica in 100 aliquote microliter utilizzando un totale di 30 tubi a microcentrifugo.
Conservare le aliquote in un congelatore a meno 20 gradi Celsius. Il congelamento flash con azoto liquido non è necessario. Scongelare la sospensione lipidica e trasferire una goccia di sospensione a quattro microliter su uno scivolo del microscopio di vetro pulito o su uno scivolo di copertura.
Dopo 20 minuti di essiccazione, la goccia collasserà in un film circolare piatto di lipidi visibile all'occhio. Reidratare il film lipidico con un millilitro di tampone HEPES per 3 minuti. Preparare la camera di osservazione con un piano aperto per consentire lo scambio tampone tramite una pipetta automatica, necessaria per avviare la trasformazione ER come descritto nel protocollo di testo.
Dopo aver rimosso la lastra PDMS polimerita con una spatola, utilizzare un bisturi per tagliare il telaio nelle dimensioni e nella geometria appropriate per l'apertura disponibile nella fase del microscopio. Dimensioni di 1,5 per 1,5 per 0,5 centimetri sono adatte per la maggior parte delle configurazioni. Portare il lato liscio del telaio PDMS a contatto con il lato attivo della superficie in cui risiede il film di ossido di alluminio e applicare delicatamente la pressione per spingere il telaio e la superficie l'uno contro l'altro per farli aderire.
Riempire immediatamente la camera di osservazione con tampone HEPES di calcio. Non riempire l'intero volume della camera per consentire l'aggiunta dei lipidi reidratati nella fase successiva. Posizionare la camera sullo stadio del microscopio confocale.
Trasferire il materiale lipidico reidratato, ora una sospensione contenente vescicole giganti, nella camera con una pipetta da pascolo di plastica. Attendere da 10 a 20 minuti per lasciare che le vescicole aderiscano al substrato e si diffondano sulla superficie. La diffusione inizia immediatamente dopo la deposizione di lipidi sulla superficie.
Prima che il lipide diffonda la struttura, lo scambio tampone deve essere fatto il più delicatamente possibile rimozione rapida o rapida aggiunta del tampone perturba le strutture lipidiche sulla superficie. Dopo aver osservato più diffusioni lipidiche, rimuovere lentamente il tampone ambientale tramite pipetta automatica. Tale che solo una sottile pellicola tampone rimane sul fondo.
Fare attenzione ad evitare una rapida rimozione. Procedere allo scambio tampone ambientale riempiendo lentamente la camera di osservazione con tampone HEPES chelatore utilizzando una pipetta automatica. Evitare un'aggiunta improvvisa.
Il passo finale produce reti nanotubulari dinamiche formate come risultato del depinning indotto dal chelatore e dalla retrazione del DLBM alle vescicole multilamellari. Qui sono mostrate le micrografie delle reti di nanotubi ottenute nel protocollo. In questa immagine, le regioni rosse brillanti continue sono la frazione retrattile del DLBM, contrassegnata da una linea tratteggiata blu.
Qui è mostrata una micrografia di una rete tubolare che è stata invertita per aumentare il contrasto. Qui, la riduzione della densità tubolare è mostrata su una regione della membrana nel corso di tre ore e 20 minuti. La diminuzione della densità tubolare si verifica a causa del graduale depinning seguito dalla retrazione del DLBM dalla superficie.
Le posizioni dei punti di inchiodatura mediati dal calcio possono essere stabilite come i punti in cui i tubi hanno curve terminali o bruschi. Le curve acuti sono indicate come giunzioni a V o punti di svolta a causa dell'improvviso spostamento in direzione dell'allineamento dei tubi. Il punto finale rappresenta il capolinea del tubo che impedisce al tubo di ritrarsi.
Se la diffusione continua per periodi prolungati, la tensione della membrana aumenta portando a rotture. Poiché i lipidi sono etichettati fluorescentmente, la rupturing può essere osservata direttamente. Un indicatore chiave della rupturing è il calo significativo dell'intensità di fluorescenza nella regione di rottura.
Una completa disidratazione del campione o un rapido scambio di tamponi causano disturbi, rupturing o deformazione delle patch. La complessità del modello può essere costruita aggiungendo componenti associati all'ER come le proteine lipidiche. E questo modello può anche essere implicito per studiare l'auto-assemblaggio, le nanofluidici, il flusso di Marangoni e i fenomeni di trasporto.
Il cloroformio è tossico e altamente volatile, deve sempre essere maneggiato sotto una cappa aspirante e con dispositivi di protezione individuale associati, tra cui guanti da laboratorio in acetato di polivinile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.
