Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı hibe # MCB-0741914 ve MCB-0843627 tarafından desteklenmiştir; ek altyapı desteği 2 Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi&#39;nden G12 RR03060-26 tarafından New York City College sağlanmıştır. Biz minnetle JKC M82 (yabani tip) ve CM15 (mutant) domates tırnak etlerini sağlamak için Cornell Üniversitesi Bitki Biyolojisi Bölümü grup Rose kabul ediyorsunuz. Biz AFM deneyler yaptığı cömert yardım için Prof Alexander Couzis arasında CCNY Kimya Mühendisliği grubundan Dr Spyros Monastiriotis teşekkür ederim. Biz grafik tasarım desteği için Bayan Lauren Gohara teşekkür ederim.

1. Domates Enzimatik İzolasyon 5 cuticles <ol><li> Bir kabın içinde birkaç ticari veya ekili domates yerleştirin. Büyük bölümlerde meyvelerden cilt soyma; iç perikarp doku atın. Deiyonize su ile domates derileri yıkayın ve bir bardak su altında onları korumak. </li><li> 200 ml ekleyerek, sodyum asetat trihidrat, 1.22 g (M r. 136,08 g / mol) ve bir cam kapta 2,34 ml glasiye asetik asit (17,485 M) koyarak, bir 50 mM pH 4.0 sodyum asetat tampon (31 ° C de) hazırlanması 31 de 4.0 ila pH ayarlama sonra deiyonize su ve ° C. , Ve 13 mg NaN 3;, selülaz ve 0,2 g (1,3 birim / mg katı, Sigma Aldrich EC 232.734.4); pektinaz (10 U ml -1, TCI Amerika EC 3.2.1.15) 4 ml ihtiva eden bir karışım hazırlamak ve daha sonra nihai enzim kokteyli ile 200 ml elde etmek için enzim karışımına sodyum asetat tampon 196 ml ilave edilir. 5 tamamen enzim kokteyli içinde soyulmuş domates cilt batırmak ve inkübe31 ° sabit tokalaşma (G24 Çevre İnkübatör Çalkalayıcı; New Brunswick Scientific Co) ile 24 saat C. </li><li> Bir mutfak süzgeç veya Büchner hunisi ve deiyonize su ile yıkayın kullanarak domates derileri toplayın. Bundan sonra, bir saat boyunca oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde yerleştirin. Sonraki Mum eritme işlemleri için etiketli ve kapağı kapatılmış şişe içinde kurutulmuş domates derileri koruyun. </li></ol> 2. Soxhlet Ekstraksiyon 6 tarafından ayrıntılı Mum eritme <ol><li> Ayrıntılı Mum eritme için kullanılan ekipmanlar bir ısı kaynağı (ısıtma manto ve Varyak Kontrolü), bir çözücü rezervuar için yuvarlak dipli bir şişe, Soxhlet çıkarıcı, sinterlenmiş cam yüksük veya tek kullanımlık ekstraksiyon yüksük, anti-darbeleme cips ve bir kondansatör (bkz. Şekil oluşur. 1). Dar sifon kolu (parça Şekil 6 ve 7. 1) dikkatli kullanım gerektiren, çok hassas ve kırılmaya eğilimli olduğunu unutmayın. </li><li> (Elde edilen domates cilt 0.5-1 gr koyun, bir havan içinde adım 1). ve numuneler AFM ölçümleri (Bölüm 5) kullanılmak üzere, bir sürece havaneli ile bir kaba toz öğütülmesine. Numune ile yaklaşık yarım bir sinterlenmiş cam veya tek yüksük doldurun ve ekstraksiyon sütunun dibinde dikkatlice yerleştirmek için cımbız kullanın. </li><li> Kondansatör takın ve alüminyum folyo ile sarın. Birkaç anti-çarpma yongaları mevcudiyetinde metanol solvent (ACS derecesi) ısıtmak şişenin duvarları üzerine nazikçe kaynar ve reflü kadar. Cam yünü ve alüminyum folyo ile hem solvent rezervuar örtün. Yüksük dolduğunda Soxhlet aygıtı içinde rezervuar saniyede yaklaşık bir damla birikir, böylece Varyak gerilimi ayarlayarak ve sifon, bir saat süreci oluşur kontrol edin. </li><li> , 12 saat çıkarma işlemi devam sonra ısıtma manto düşürüp aparat soğumasını bekleyin. Solvent kurtulmak için tek bir birim olarak aspiratör ve rezervuar çıkarın. Cımbız kullanınrs, sadece ekstraksiyon sütunun boyun altından yüksük yükseltmek ondan çözücü aşırı drenaj ve temiz bir yüzey üzerine yüksük yerleştirmek. Aşağıdaki balona sifon izin ekstraksiyon sütun eğin. Matara çıkarın ve etiketli bir atık solvent yuvasına atık dökün. </li><li> Giderek azalan kutup, her durumda 12 saat örneğin, kloroform ve heksan arda çözücüler için adımları 2.3 ve 2.4 tekrarlayın. </li><li> Domates kütin Örnek yüksük içinde, ya da bunun içinde azot gazı akımı üfleme ile veya oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde yerleştirerek kurumasına izin verir. Son olarak, kuru numune kütlesinin ölçmek ve parafilm ile sızdırmaz bir vida-top kavanoz oda sıcaklığında depolamak. </li></ol> 3. Epikütikülar ve Intracuticular Mumlar 3,4 Seçici İzolasyon <ol><li> İlk olarak, distile su ile bütün domates (1 açıklananlardan domates ayrı bir toplu iş.) Yıkayın. Pap ile kurulayıner havlu ve Kimwipes, yer ve bunların alüminyum folyo parçasının üzerine aşağı kaynaklanıyor. </li><li> % 120 (w / w, kütle oranı) moda yukarıdan aşağı gum arabic sulu çözeltisi ile bütün domates Boya ve ince bir film tabakası bırakarak Meyvelerin üzerinde kurumaya arap zamkı, için yaklaşık bir saat bekleyin. Delmeyiniz domates cilt için dikkatli olmak, cımbız kullanarak bu filmi çıkarın. Bir kez daha aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Üç dakika süreyle 01:01 (v / v) kloroform-su ve karışım ihtiva eden şişeler için film ekleyin. Kuvvetli çalkalama ve faz ayrılması sonra, kloroform kesirler dışarı Pipeti ve epikütikülar mum bırakarak, ayrı açığa flakonlarda onları buharlaşır. Domates fiziksel kalacaktır. , Oda sıcaklığında iki dakika süreyle kloroform içine daldırma ve çözücü buharlaştırılır sonra intracuticular balmumu toplamak. Şimdi, domates kabuğu ve (olarak açıklanan sırasıyla, selüloz ve pektin kaldırmak için (sodyum asetat tamponunda selülaz ve pektinaz ile) enzimatik muamele <strong&gt; 1). </li><li> Eğer istenirse, değişen polariteyi üç çözücüler (sırasıyla, metanol, kloroform, ve heksan) kullanılarak, (adım 2&#39;ye bakınız) Soxhlet ekstraksiyonu ile bu enzimatik olarak izole cuticles üzerine ayrıntılı Mum eritme gerçekleştirmek. </li></ol> 4. Çapraz polarizasyon tarafından Domates Meyve Kütin Moleküler Karakterizasyonu Magic açılı İplik Solid state Nükleer Manyetik Rezonans (CPMAS SSNMR) 6 <ol><li> Satıcı tarafından sağlanan ambalaj aracını kullanarak bir 1.6 mm fastMAS zirkonyum rotor tam mumu alınmış domates tırnak etlerini (cutins) Yeri 4-6 mg. (Yer mumu alınmış domates tırnak etlerini ya da kısmen mumu alınmış tırnak etlerini çok küçük parçalara Ya uygundur.) Rotor, çok sıkı olmayacak örnek eşit dolu olduğundan emin olun, ama. Üst kapağı üzerine konulduktan sonra, spin oranı ölçümleri kolaylaştırmak için siyah mürekkep marker kalem ile kap yarısını boyayın. </li><li> Yarım yükseklikte minimum spektral çizgi genişliği için NMR spektrometresinin layneri ayarlayınnd proton (1 H) kalibre ve karbon (13 C) 90 gibi adamantan gibi standart bir bileşik kullanılarak ° puls genişliklerinin. </li><li> Modeli bileşikler olarak glisin veya glutamin kullanarak, (Hartmann-Hahn eşleşen güç seviyeleri, 1 H - 13 C temas süresi, heteronükleer 1 H dekuplaj gücü) tüm parametreleri optimize ederek maksimum sinyal yoğunluğu elde çapraz polarizasyon sihirli açı eğirme (CPMAS) deney. , 600 MHz 1 H frekansta elde spektrası için tavsiye edilen koşullarda 10 kHz veya 15 kHz iplik frekansı, satın alma arasında bir 3-sec gecikmesi ve 185 kHz arasında bir frekans eşdeğer bir manyetik alan kuvveti azından 7 ayırımı SPİNAL heteronükleer proton içerir. </li><li> Prob içine kütin dolu rotor yerleştirin. Sonra, mıknatıs içine prob yerleştirin. Yavaş yavaş iyi bir örnek ambalaj ve rotor stabilite kontrol etmek için 10 kHz iplik hızını arttırın. Rotor nihai eğirme istikrar içinde doğrulayın± 20 Hz. </li><li> Ayar ayarlayın ve probu kapasitörler eşleşen iteratif 1 H ve 13 C NMR frekansları hem de minimum güç yansıma elde etmek. 25 ila deney sıcaklığı ayarlanır ° C (veya oda sıcaklığı). </li><li> 10 kHz iplik frekansta tespit Hartmann-Hahn eşleşen koşuluna karşılık gelen önceden optimize CPMAS deneyi başlar. </li><li> Üstel (Lorentz) hattı 50-100 Hz genişletilmesi ile 4096 geçici, durumu spektrum edinebilir ve bir Fourier sinyal yoğunluğu vs kimyasal koruyucu (ppm) bir NMR spektrumu oluşturmak için dönüşüm yapmak. </li><li> Standart olarak 8 - 13 C kimyasal dışarıdan 38,4 ppm (-CH grup 2) adamantandır seti kullanarak kaymaları Başvuru. </li><li> 15 kHz open end iplik sıklığını artırmak ve bu ikinci iplik sıklığı tespit Hartmann-Hahn eşleşen koşuluna karşılık gelen CPMAS ölçümü (adımları 4,6-4,8) tekrarlayın. </li><li> Repedoğal (balmumu) ve kısmen mumu alınmış meyve kütikül örnekleri ile CPMAS deneyler (adım 4,1-4,9) at. </li></ol> 5.. Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Domates Tırnak Yüzey sondalama (Dijital Aletler NanoScope IIIa; prosedürleri mikroskoplar arasında biraz değişir) 6 <ol><li> Taramalı prob mikroskobu (SPM) açın (Şekil 2) ve mikroskop moduna geçiş anahtarı kontak Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) moduna ayarlı olduğundan emin olun. </li><li> Elle iki kullanıcı-ayarlanabilir ön düğmeleri çevirerek SPM başını yükseltmek. Başın arka kısmındaki sıkma vidasını SPM başından AFM tipholder ayırın. </li><li> Tipholder varolan AFM konsol kaldırmak için cımbız kullanın, sonra dikkatlice ambalajından yeni bir silisyum nitrür konsol (AFM prob) yakala ve eski konsol yerine takın. Yeni yüklenen AFM konsol bozuk olmadığını doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. </li><li> Inci takıne domates kütikül örnek çift taraflı bant ile bir paslanmaz çelik disk (örnek puck) ile (kısmen mumu alınmış domates kütikül bir bölümü ~ 10 mm x 10 mm). Kütikül yüzeyi düz ve cin üzerindeki numunenin yerleştirilmesinden sonra pürüzsüz kalır doğrulamak için bir ışık mikroskobu kullanın. </li><li> SPM tarayıcının üstündeki manyetik bölgenin üzerine domates kütikül numune ile disk yerleştirin. </li><li> Düğmeleri çevirerek yüksek tarayıcının ön iki manuel ayar vidası ayarlayın; diğer iki ön vida yaklaşık aynı seviyeye motorlu arka ayar vidası ayarlanır. Her üç vida SPM kafasına tipholder yerleştirirken AFM ucu bozulmaması için yeterince yüksek ayarlandığından emin olun. </li><li> SPM kafasına tipholder tekrar takın ve başın arka kısmındaki sıkma vidasını sıkarak sabitleyin. </li><li> Lazer açtıktan sonra, kafasının üstüne merkezi (y) ve sağ (x) lazer ayar dügmesini kullanarak AFM konsol üzerinde lazer nokta hizalayın.Tam AFM konsol sonunda lazer nokta konumlandırmak için bir kağıt parçası üzerine yansıtılan lazer ışını izleyin. </li><li> Hareketli ayna iteratif Böylece yansıyan lazer ışını Fotodedektör dört kadranda tarafından eşit alınmadığını sağlayarak, maksimum sinyal (SUM sinyali) ulaşmak için fotodetektör ayar dügmesini kullanarak pozisyonunu ayarlayın. </li><li> Görsel bir inverted mikroskop ile örnek yüzeyine doğru AFM ucunun yaklaşım izlenmesi, geri çekme manuel ayar ön vida ile AFM ucu ve SPM tarayıcının motorlu arka ayar vidası indirin. Her üç vida görüntüleme eğik bir örnek eserler önlemek için aynı seviyede olduğundan emin olun. Örnek doğru ucu getir, ama çok yakın değil ki ucu dokunuyor veya numune yüzeyi boyunca tatili. </li><li> Bu noktada, lazer ışığı AFM konsol fotodetektör için hareketli ayna sıçrama olacak yansıyan. Bir silikonlu yağla temas AFM modu içincon nitrür AFM ucu, bir 0 V istenen ve DIFF Sinyal (yatay / dikey fark), ayna konumunu ayarlayarak 0 V için -2 V ÇIKIŞ sinyali (Dikey Saptırma) gerilimini ayarlayabilirsiniz. </li><li> NanoScope yazılımı kullanarak, mikroskop ikonuna tıklayın ve uygun profili (İletişim modu AFM) seçin. </li><li> &quot;Tarama Kontrolleri Ayarlar&quot; panelini kullanarak, tarama hızı ve tarama boyutu örneğin, 10 mikron tarama boyutu ve 2 Hz tarama hızı ayarlayın. </li><li> AFM ucu meşgul ucu simgesini tıklatarak numune yüzeyi yapmaya izin verin. Bu numune yüzeyine kavrayana kadar SPM baz motorlu arka vida kontrol ederek, programı artık ucu düşürecektir. Ucu başarıyla yapan sonra tarama işlemi otomatik olarak başlayacaktır. </li><li> Iteratif en yüksek ulaşmak için bu set, integral kazanç, oransal kazanç, tarama boyutu, tarama hızı, çizgiler ve örnekler / hat gibi parametreleri ayarlayarak, yazılım görüntü ve kapsamı modları kullanarak tarama sürecini izlemekçözünürlüklü görüntüler. Büyük bir z ekseni aralığı (veri ölçek) ile tarama işlemini başlatın, sonra dikkatlice görüntü üzerinde yüzey özelliklerinden en iyi kontrast gözlemlemek için veri ölçek değerini düşürün. Yüzey özellikleri yüksekliği kullanılabilir z-ekseni aralığı aşan göstermektedir taranmış görüntü, beyaz alanların oluşumunu en aza indirmek. </li><li> Veri dosyasını kaydetmek için görüntü yakalamak, sonra tarama çizgileri arasındaki ofset düşey (Z) tarayıcı sürüklenme, görüntü fiyonklar ve dikey nedeniyle resim gölgeleri kaldırmak için düzleşme fonksiyonlarını kullanarak verileri işlemek; 9 nihayet ortalama pürüzlülüğü hesaplayabilirsiniz. Verilerin kaydedilmesi sonra, angaje için kullanılan, bilgisayar kontrollü motor vida işlemin geri tarafından AFM ucu geri. Görüntü işleme isimli görüntü analiz modu ve / yapılan veya farklı bir bilgisayar kullanıyor olabilirsiniz. </li><li> Tarama alanının x ve y pozisyonlarını değiştirmek için ucu sahibinin ön alt gri metal düğmeler kullanın; sonra beş numune loca az ölçümü tekrarlayınızsınırların dışına görüntü kalitesi bozulur eğer AFM konsol yerine, tekrarlanabilirlik kontrol etmek. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar CPMAS 13 C NMR kimyasal kayma analizi (Şekil 3) etraflıca mumu alınmış domates kütikül (kütin) bulunan temel fonksiyonel gruplar belirlendi. Kütin biopolyester kilit karbon yarımlar uzun zincirli alifatik (0-45 ppm), oksijenli alifatik (45-110 ppm), çarpma-yapıştırılmış ve aromatik (110-160 ppm) ve karboniller (160-220 bulunmuştur ppm). Oksijenli alkil yarımları (CHO + CH2 O) böylece kütin matrisin moleküler mimarisini oluşturan, kütin biopolimer arasında monomer birimleri arasında kovalan bağlantı kuran önemli bir rol oynamaktadır. 45 ve 100 ppm arasında spektral bölgede gözlenen göreli pik alanları farklılıklar mutant kütin çapraz bağ oluşturan CHO structura nispeten büyük oranda sahip olduğunu düşündürmektedir<html> l kısımlara göre yabani tip kütin; doğrudan polarizasyon (DPMAS) NMR 5 yöntemlerini kullanırken dikkatli ölçümlerle bu çıkarsama destekleyen (veriler gösterilmemiştir). CPMAS 13C NMR spektrası, aynı zamanda kütin biopolimer başlıca kimyasal mimarisini koruyarak kütin-balmumu kompozit gelen epi-ve intracuticular mumların sıralı çıkarılması gösteren, 31 ppm (Şekil 4) aşamalı olarak azalan bir balmumu tepe değeri göstermiştir. Paralel AFM görüntü analizi (Şekil 5) cuticular montaj organizasyonunda değişiklikler gösteren, meyve kütikül gelen epi-ve intracuticular mumların kademeli ekstraksiyon nedeniyle yüzey düzensizliklerini tespit edildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . Şekil 1 Soxhlet çıkartma (görüntü kaynak: Wikipedia). &quot;/&gt; Şekil 2. A) Tarama prob mikroskop. B) SPM kafa (Dijital Instruments tarafından sağlanan AFM eğitim el kitabı uyarlanmıştır). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> Şekil 3. Yaban-tip (M82) ve mutan etraflıca mumu alınmış kırmızı olgun domates meyve cuticles (cutins), 150 MHz CPMAS 13C NMR spektrumu (CM15) kimyasal rezonans gösteren bir çapraz bağlı hydroxyfatty asitin işlevsel gruplara karşılık gelen kaydırır -polyester bazlı ve ayrıca bazı çarpma gümrüklü kısımları. Tüm spektrumları 10 kHz frekans ile iplik elde edildi. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> Şekil 4. Ticari kırmızı olgun domates meyve tırnak etlerini 150 MHz 13 CCPMAS NMR sıralı Arap zamkı mekanik ekstraksiyon epikütikülar ve intracuticular mumlar çıkarılması ve bir tw üzerine kompozisyon değişikliklere rastlanabiliro dakika kloroform daldırma, sırasıyla. Tüm spektrumları 15 kHz frekans iplik ile elde edildi. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> Şekil 5. AFM görüntüleri ve kısmen mumu alınmış ticari domates pürüzlülüğü tahminleri epikütikülar (solda) ve intracuticular (sağda) mumların aşamalı çıkarılmasından sonra Şekil 4&#39;te açıklanan cuticles.

<ol>
	<li>Dom#237;nguez, E., Heredia-Guerrero, J. A., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysical+design+of+plant+cuticles:+an+overview.">The biophysical design of plant cuticles: an overview.</a> New Phytologist. 189, 938-949 (2011).</li><li>Bargel, H., Koch, K., Cerman, Z., Neinhuis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+plant+cuticle+and+cuticular+waxes+-+a+smart+material?.">Structure-function relationships of the plant cuticle and cuticular waxes - a smart material?.</a> Functional Plant Biol. 33, 893-910 (2006).</li><li>Jetter, R., Sch&#228;ffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Composition+of+the+Prunus+laurocerasus+Leaf+Surface.+Dynamic+Changes+of+the+Epicuticular+Wax+Film+during+Leaf+Development.">Chemical Composition of the Prunus laurocerasus Leaf Surface. Dynamic Changes of the Epicuticular Wax Film during Leaf Development.</a> Plant Physiol. 126, 1725-1737 (2001).</li><li>Vogg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties:+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+Î²-ketoacyl-CoA+synthase.">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid Î²-ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exper. Botany. 55, 1401-1410 (2004).</li><li>Isaacson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutin+deficiency+in+the+tomato+fruit+cuticle+consistently+affects+resistance+to+microbial+infection+and+biomechanical+properties,+but+not+transpirational+water+loss.">Cutin deficiency in the tomato fruit cuticle consistently affects resistance to microbial infection and biomechanical properties, but not transpirational water loss.</a> Plant J. 60, 363-377 (2009).</li><li>Round, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Water+on+the+Nanomechanical+Behavior+of+the+Plant+Biopolyester+Cutin+as+Studied+by+AFM+and+Solid-State+NMR.">The Influence of Water on the Nanomechanical Behavior of the Plant Biopolyester Cutin as Studied by AFM and Solid-State NMR.</a> Biophysical J. 79, 2761-2767 (2000).</li><li>Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Broadband+Decoupling+Sequence+for+Liquid+Crystals+and+Solids.">An Improved Broadband Decoupling Sequence for Liquid Crystals and Solids.</a> J. Magn. Reson. 142, 97-101 (2000).</li><li>Morcombe, C. R., Zilm, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+shift+referencing+in+MAS+solid+state+NMR.">Chemical shift referencing in MAS solid state NMR.</a> J. Magn. Reson. 162, 479-486 (2003).</li><li>Fang, S. J., Haplepete, S., Chen, W., Helms, C. R., Edwards, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+atomic+force+microscopy+images+using+spectral+methods.">Analyzing atomic force microscopy images using spectral methods.</a> J. App. Phys. 82, 5891-5898 (1997).</li><li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+lipid+barriers:+biosynthesis+of+cutin+and+suberin.">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends. Plant Sci. 13, 236-246 (2008).</li><li>Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+dynamics+in+fruit+cuticle+polyesters.">NMR studies of structure and dynamics in fruit cuticle polyesters.</a> Solid State Nucl. Mag. 16, 37-45 (2000).</li><li>Schaefer, J., Stejskal, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon-13+nuclear+magnetic+resonance+of+polymers+spinning+at+the+magic+angle.">Carbon-13 nuclear magnetic resonance of polymers spinning at the magic angle.</a> J. Amer. Chem. Soc. 98, 1031-1032 (1976).</li><li>Sachleben, J. R., Chefetz, B., Deshmukh, A., Hatcher, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-State+NMR+Characterization+of+Pyrene-Cuticular+Matter+Interactions.">Solid-State NMR Characterization of Pyrene-Cuticular Matter Interactions.</a> Envir. Sci. &#38; Tech. 38, 4369-4376 (2004).</li><li>Zlotnik-Mazori, T., Stark, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+cutin,+an+insoluble+plant+polyester.">Nuclear magnetic resonance studies of cutin, an insoluble plant polyester.</a> Macromolecules. 21, 2412-2417 (1988).</li><li>Stark, R. E., Garbow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+relaxation+studies+of+plant+polyester+dynamics.+2.+Suberized+potato+cell+wall.">Nuclear magnetic resonance relaxation studies of plant polyester dynamics. 2. Suberized potato cell wall.</a> Macromolecules. 25, 149-154 (1992).</li><li>Bennett, A. E., Rienstra, C. M., Auger, M., Lakshmi, K. V., Griffin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteronuclear+Decoupling+in+Rotating+Solids.">Heteronuclear Decoupling in Rotating Solids.</a> J. Chem. Phys. 103, 6951-6958 (1995).</li><li>Metz, G., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ramped-Amplitude+Cross-Polarization+in+Magic-Angle-Spinning+NMR.">Ramped-Amplitude Cross-Polarization in Magic-Angle-Spinning NMR.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 110, 219-227 (1994).</li><li>Peersen, O. B., Wu, X. L., Smith, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+CP-MAS+Signals+by+Variable-Amplitude+Cross-Polarization+-+Compensation+for+Inhomogeneous+B-1+Fields.">Enhancement of CP-MAS Signals by Variable-Amplitude Cross-Polarization - Compensation for Inhomogeneous B-1 Fields.</a> J. Magn. Reson. Ser. A. 106, 127-131 (1994).</li><li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+a+versatile+tool+in+biophysics.">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. &#38; Tech. 16, 10-1088 (2005).</li><li>Ben&#237;tez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques.">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li><li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+(AFM).">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science.">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Protokoller Burada yıkıcı kimyasal dökümü için gerek kalmadan karmaşık dirençli bitki materyali ayrıntılı moleküler ve mikro karakterizasyonu için izin nitelendirdi. Biz heterojen cuticular karışımından epikütikülar ve intracuticular mumların seçici çıkarılması için prosedürler yürütülen ve izlenen cuticular montaj yapısal organizasyon, 10 kontrol, çeşitli lipidler (balmumu) ile kütin biopolyester harmanlama araştırmak. Solid-state 13 C NMR ekili wild-tip ve tek-gen cutins arasında çapraz bağlantı yeteneklerini karşılaştırmak için balmumu moleküler bileşenleri çıkarıldığı ölçmek için kullanılan, ve atomik kuvvet mikroskobu yüzey pürüzlülüğü eş zamanlı değişiklikleri incelemek için görev yaptı. 6,11 oldu mutant domates meyveleri, katı hal 13C NMR da CHO ve CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları tahmin etmek için kullanıldı. Tasarım özelliği bir diziBu protokol s dikkat çekicidir. Balmumu malzemeleri farklı kutuplar sahip solventler bir dizi meyve kütikül tedavisinde, lipidler geniş bir kapsayacak şekilde ayrıntılı Mum eritme elde etmek esastır. Buna ek olarak, Mum eritme süresi 8 saat arasında kütikula örnekleri doğasına bağlı olarak, 24 saate kadar değişmektedir. Sağlam meyve kütikül gelen sürekli epikütikülar mumlar ayıklamak için, yüzeye eşit yapışkan kaplama uygulamak şarttır. Solid-state CPMAS 13 C NMR 12 kendi doğal fiziksel özelliklerini koruyarak oldukça heterojen ve çözünmez bitki biyopolimerlerin çeşitli yapısal bileşenlerinin belirlenmesi için hızlı bir kalitatif yöntemdir; 13 geleneksel çözüm-devlet NMR da ayıklanan balmumu karışımları karakterize etmek için kullanılabilir. Fonksiyonel grupların nicel tahmin bozulmamış bitki polimerler, 5 yüksek kaliteli doğrudan polarizasyon sihirli açı iplik (D isteniyorsaPMAS) 13C NMR 5,14 tamamlayıcı bir yöntem olarak kullanılabilir. Fonksiyonel grupların doğru kantitatif geri dönüşüm süreleri, uyarma darbe uzunlukları ve heteronükleer çözülmenin gücü dikkatli optimizasyonu gerektirir. 15 heteronükleer dekuplaj TPPM 16 veya 50 kHz ile 185 kHz arasında değişen 1 H alan şiddeti için ayarlanabilir SPİNAL 7 metodolojileri. Bu parametrelere ek olarak, CPMAS ölçümlerin hassasiyeti spin-kilit zaman ve Hartmann-Hahn eşleşen durumuna bağlıdır. Geleneksel CPMAS yerine 15, rampalı bir amplitüdlü CP (RAMPA-CP) tekniği çapraz üst düzeye çıkarmak için uygulanabilir spin-kilit süresi (veya tersi) sırasında sabit 13 C alan gücü genliği tutarken lineer 1 H genliği değişen (~% 20-50) veya teğet by-polarizasyon verimliliği. az CPMAS ölçümleri yapılması 17,18 İki farklı ro minimumtor-iplik frekansları ana spektral tepelerinden iplik sidebands ayırt etmek şarttır. Temas şeklinde yapılan eşzamanlı AFM ölçümleri mumsu bileşenlerinin sıralı çıkarılması sırasında, örneğin yüksek tarama hızı ve yüksek çözünürlüklü, 19 ile kütikül yüzey durumunun doğrudan görüntüleme sağlar. Her iki durumda da (temassız) modu yanal (kesme) kuvvetleri nedeniyle olası hasar kaçınarak ve numune yüzey kazıma, narin &quot;yumuşak&quot; Bitki materyallerinin yüzey karakterizasyonu için bir alternatif olarak kullanılabilir. 5,20 dokunarak yılında AFM İşletim , yüzey üzerinde aynı noktada birden fazla görüntü sıralı satın AFM ölçümlerde &quot;prob-yüzey etkileşimleri&quot; nedeniyle herhangi bir yüzey hasarı belirlemek için hizmet vermektedir. 6,21 iyi tekrarlanabilirlik için, yumuşak cuticular yüzeyler için uygun yay sabitleri ile AFM probları olmalıdır sıcaklık ve nem kullanılan ve süreklilik sağlanmalıdır. 6,15,20 </skadar katı hal NMR Oysa&gt; topluluk ortalaması (dökme) domates meyvesinin tırnak etlerini özelliklerin moleküler profili sunan, atomik kuvvet görüntüleme bu zarif karmaşık makromoleküler meclislerinin yüzey topografisi izlemek için tamamlayıcı bir noninvaziv prob 22,23 sağlar. 1,2

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog no.</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0026</td>
			<td>EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1184-100KU</td>
			<td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Extremely hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific Co.</td>
			<td>Model No.G24</td>
			<td>MFG No.M1036-000G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>31566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variac Controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sintered glass thimble (85 mm/25mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EMD-MX0485-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RK20789</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-452</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1050-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89002-984</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9752</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 mm fastMAS zirconia rotor</td>
			<td>Varian (Agilent)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Varian 600 NMRS</td>
			<td>standard bore magnet</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49419</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adamantane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100277</td>
			<td>To calibrate 90&deg; pulse in NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA)</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip)</td>
			<td>Veeco (Bruker AXS)</td>
			<td>Model NP-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic puck</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit Peeler</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and biophysical study of fruit cuticles

Manikür, karasal bitkilerin üstü kısımları bir hidrofobik koruyucu tabaka, çeşitli biyotik ve abiyotik streslere karşı çok yönlü bir savunma bariyeri gibi fonksiyonlar ve ayrıca dış ortamdan su akışını düzenler. 1 A biopolyester (kütin) ve uzun zincirli yağ asitleri ( mumlar) kütikül başlıca yapısal çerçeve oluştururlar;. cuticular tabakasının işlevsel bütünlüğü kütin biyopolimer ve &#39;intracuticular&#39; mumlar 2 Burada oluşan karışımı, biz kapsamlı bir protokol tarif dış &#39;epikütikülar&#39; katmanın yanı sıra bağlıdır ticari domates (Solanum lycopersicum) meyve tırnak etlerini etraflıca mumları çıkarmak için ya da kütikül kompozit arasında kademeli ve seçici epikütikülar ve intracuticular mumları çıkarmak için. Ve uygun su jetleri Schäffer (2001) yönteminin meyve kütikulasının gelen epikütikülar ve intracuticular mumların aşamalı çıkarılması için adapte edilmiştir. 3,4 izlemek içinsıralı balmumu çıkarılması, solid-state çapraz polarizasyon sihirli açı-eğirme süreci (CPMAS) 13 C NMR hakkında bilgi tamamlanmaktadır dökme malzemelerin moleküler düzeyde yapısal profiller sağlayan, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile paralel olarak kullanılmıştır mikro topografya ve cuticular yüzeylerin pürüzlülüğü. Ekilmiş vahşi tip ve tek-geni mutant domates meyveler mumu alınmış cuticles bir çapraz bağlama yeteneği değerlendirmek için, MAS 13C NMR oksijenli alifatik (CHO ve CH2 O) kimyasal yarımların nispi oranları karşılaştırmak için kullanıldı. Kütin biopolyester kimyasal yapısı korurken polariteyi değişen çözücü, bir panel ile aşamalı Soxhlet ekstraksiyon ayrıntılı Mum eritme, bunların alifatik ve aromatik bileşenlerin hidrofobik özelliklerine göre balmumu yarımlar izole etmek için etkili bir yol sağlar. Epikütikülar mumlar ve sele mekanik ekstraksiyontamamlayıcı fiziksel yöntemler ile takip intracuticular mumların ctive kaldırılması, manikür montaj araştırmak için eşi benzeri görülmemiş bir araç sağlar: Bu yaklaşım supramoleküler organizasyon ve mumlar çeşitli yapısal entegrasyon, kütin-balmumu matris mimarisi ve kimyasal açığa her bir bileşenin bileşimi. Buna ek olarak, katı halde 13C NMR vahşi tip ve kırmızı olgun mutant domates meyve ve CHO CH2 O kimyasal yarımların nispi numaraları farklılıklar gösterir. NMR teknikleri parmak izi, çözünmeyen amorf ve kimyasal heterojen cuticular malzemelerin moleküler yapısı için olağanüstü araçlar sunuyoruz. Noninvaziv bir yüzey seçkin bir görüntüleme tekniği olarak, AFM nm-mikron uzunluğunda ölçekte cuticular montaj yapısal organizasyonu araştırmak için etkin ve doğrudan vasıta vermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles at JoVE.com

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Görüntüleme.  City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies. Hava bitki organlarının kütikül, bir supramoleküler biopolyester-balmumu meclisi tarafından korunmaktadır. Biz katı hal NMR ve atomik kuvvet mikroskobu ile moleküler ve mikro ölçeklerde domates meyve tırnak etlerini gelen seçici olarak çıkarılmasına epi-ve intracuticular mumlar, sırasıyla izlemek ve mühendislik cuticular biopolyesters çapraz-bağlantı kapasitesi değerlendirmek için protokolleri sunuyoruz.

Video: Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Drosophila (meyve sineği) Saldırganlık incelenmesi

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

Elektronik Burun kullanarak Meyve Uçucu Analizi

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...