Bu protokol, yerel biyomekanik, doku mimarisi, parakrin ortamlar ve yan yana etkileşimlerde yapılan değişikliklerin hücresel fenotipi nasıl etkilediğini belirlememize yardımcı olur. Bu teknik, geleneksel grafik deneylerinde ortaya çıkan büyük ölçekli doku hakaretlerine neden olmadan klasik paradigmaları ve deneysel embriyolojiyi keşfetmemizi sağlar. Enjeksiyon için doğru basıncı bulmak için, daha düşük bir enjeksiyon basıncından başlamak ve hücrelerin sabit bir akış elde edilene kadar kademeli olarak artırmak yararlıdır.
Bu tekniğin görselleştirilmesi, enjeksiyon ekipmanının hedef dokuya göre nasıl konumlandırılması gerektiğinin doğrudan anlaşılmasına yardımcı olur. Prosedürü gösteren benim laboratuvar, Trevor Henley ve Kandace Thomas iki üyesi olacak. İmplantasyondan 24 saat önce, standart protokollere göre bir mikropipet çekmecesi üzerinde cam kılcal damarları çekin ve iğnelerin dış yüzeylerini kaplamak için kılcal damarları silikonlaştırıcı maddeye batırın.
Daha sonra, bir mikroenjeksiyon pipet ucu içine silikonlaştırıcı ajan 5 ila 10 mikrolitre yükleyin ve bir dış kaplı cam kapiller geniş ucunda ucu yerleştirin. Pipet ucunu cam iğne ucuna mümkün olduğunca yakın yerleştirin ve iğne içindeki hava kabarcıklarını en aza indirmek için yükleme pipetini yavaşça geri çekerken silikonlaştırıcı maddeyi çıkarın. Çözeltiyi aspire etmek için yeni bir yükleme pipeti kullanmadan önce silikonlaştırıcı maddeyi cam iğnede 10 dakika bekletin.
Sonra bir gecede bir duman başlık içinde iğnekurun. Ev sahibi embriyo hazırlama için, 38 santigrat derece nemli bir kuluçka yatay bir yönde verimli tavuk yumurtaları kuluçka ve yumurta ekvator boyunca her yumurtanın düz ucunun alt bir milimetre çapında delik daha büyük bir milimetre çapında delinme yapmak için açılı forseps kullanın. Yaklaşık beş mililitre albumen çıkarmak için delinmeye 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 18 kalibrelik bir iğne yerleştirin.
Ve yumurta kabuğunun üstüne şeffaf bant uygulayın. Açılı çiflizli yumurtanın üst kısmındaki bantlı bölgeyi puanlayın ve yumurtanın bantlı bölümünde yaklaşık 2,5 santimetrelik bir pencereyi kesmek için kavisli tenotomi makası kullanın. İnceleme ve Hamburger ve Hamilton tarafından belirlenen kriterlere göre embriyo sahne ve embriyo altında HBSS Hindistan mürekkep bir ila beş seyreltme yaklaşık 200 mikrolitre enjekte etmek için 32 gauge iğne ile donatılmış bir milimetre şırınga kullanın.
Daha sonra delinme şeffaf bant la kapatın ve yumurtanın nemlendirilmiş kuvöze geri yerleştirilmesi için pencereli kabuğu parafin filmle mühürlemeden önce embriyonik diske bir mililitre HBSS damla ekleyin. Embriyolar Hamburger ve Hamilton evre 19 ulaştığında, deiyonize su ile silikon kaplı cam kılcal durulayın ve kılcal oda sıcaklığında üç ila dört saat kurumasını bekleyin. Bu süre zarfında, bir yumurtadan bir embriyoyu steril oda sıcaklığıNDA HBSS içeren 100 ila 15 milimetrelik Petri kabına aktarın ve kabı stereo mikroskop altına yerleştirin.
Forseps, tenotomi makası ve mikro spatula kullanarak tüm embriyonik kalbi embriyodan izole edin ve atria'yı kalpten izole edin. Atriyal dokuyu steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne buz üzerinde bir mililitre HBSS içeren yerleştirin. Tüm donör doku toplandı zaman, sabit açılı mikrosantrifüj santrifüj ile dokular pelet.
Donör doku sindirimi için, dakikada 300 rotasyonda sallayarak ısı bloğunda 15 dakikalık bir kuluçka için önceden ısıtılmış %05 tripsin EDTA'nın mililitresinde peletleri yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, pipet sindirim çözeltisi kalan doku kırmak ve santrifüj ile kardiyak lysate pelet birkaç kez. Başka bir santrifüj için bir mililitre trypsin nötralize çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın ve ardından 400 mikrolitre kırmızı floresan boya çözeltisinde yeniden süspansiyon.
37 santigrat derecede 20 dakika sonra, yıkama başına HBSS bir mililitre bir ila üç yıkar için santrifüj ile hücreleri pelet. Daha sonra etiketli hücreleri taze HBSS'deki mikrolitre konsantrasyonu başına dördüncü hücrelere beş kat on oranında yeniden askıya alın. Donör hücrelerin in vivo enjeksiyonu için, hücre süspansiyonu gösterildiği gibi kuru, silikon lailgili cam kılcal pipete geri yükleyin ve pipeti basınçlı mikroenjektör aparatına monte edin.
Her konak embriyoyu, nemlendirilmiş kuvözden floresan stereo diseksiyon mikroskobu altında bir yumurta tutucuya enjekte edilecek şekilde aktarın. Ve vitellin membranaçmak için steril ince forceps kullanın. Perikard'da 5-1 milimetrelik bir kesi yapın ve mikroenjeksiyon iğnesinin ucunun hedef dokuya nüfuz etmesi için mikroenjektörü yerleştirin.
Mikroenjektörü, 100 ila 400 hektopascal arasında değişen tek darbeleri 5 saniye boyunca basınçta uygulayacak şekilde ayarlayın. Ve hücrelere basınç enjekte edin. Yumurtayı yeniden mühürlemeden önce floresan sinyali görüntüleyerek başarılı bir hücre implantasyonunun doğrulanması çok önemlidir.
Embriyo da bu prosedürü belgelemek için fotoğraflandı olabilir. Tüm hücreler enjekte edildiğinde, mikroenjektör aparatını geri çekve yumurtayı tutucudan çıkarın. Sonra embriyo üzerine sıcak HBSS damla akıllıca bir mililitre ekleyin.
Yumurtayı şeffaf ambalaj bandıyla kapatın ve yumurtayı implantasyon sonrası 24 saat boyunca nemli kuvöze geri gönderin. Burada donör atriyal miyosit implantasyonu sonrası konak embriyonik kalbin kalbi ve çevresindeki dokular gösterilmiştir. Bu temsili deneyde, donör hücreler benzer bir aşamada bir konak embriyo proepicardium içine mikro enjekte edildi.
Konfokal mikroskop kullanılarak yapılan optik kesitler, proepikardiyum daki tek kardiyak kas belirteç pozitif hücrelerinin fokal implante edilmiş floresan kırmızı pozitif hücreler olduğunu ortaya koymuştur. Kalpte yırtıklar ve enjeksiyon iğnesinin neden olduğu lokal damar yırtılması canlılığın azalmasına neden olabileceğinden alıcı embriyoyu aşırı manipüle etmemeye özen. Bu prosedürü takiben, immünohistokimya, yerinde hibridizasyon ve hücre sıralama dahil olmak üzere, downstream tahliller çeşitli yapılabilir.
Silikonlaştırıcı madde son derece yanıcı ve akut toksiktir. Her zaman bir duman başlık içinde bakım ve uygun kişisel koruyucu ekipman ile ele alınmalıdır.
