Biz mikroskopi analizi ve kardiyak onarım, Teknisyenlerin ve hayvan tesis Yöneticisi ilgili projelerinin desteklenmesi için Magdi Yacoub Enstitüsü (Myi) teşekkür ederim. Bu çalışma İngiliz Kalp Vakfı (BHF), Proje hibe PG/10/019 tarafından desteklenmiştir. MPS myi ve BHF tarafından desteklenmektedir. TP Bir BHF-Araştırma Mükemmellik üyesidir. NR bir NH &amp; MRC Avustralya üyesidir.

Tüm hayvan çalışmaları, uluslararası (Avrupa Parlamentosu Direktifi 2010/63/EU Sayılı) ve ulusal (UK Home Office, Act 1986) düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır. Burada açıklanan prosedürler İngiltere lisans otoriteleri altında çalışma planımızın bir parçası olan ve kayıt amacıyla alınan olmamıştır. 1.. Hücreler hazırlanması Bu protokol, gösterim amacıyla, belirli bir hücre çizgisi (insan embriyonik böbrek HEK293 hücreleri) hazırlanmasını tarif etmektedir. Hücre-özel protokoller büyüyen ve sonunda belirli bir hücre soyları içine pluripotent veya yetişkin kök hücreleri farklılaştırarak için istihdam edilmelidir. <ol><li> DMEM ortamı,% 1 sodyum piruvat, 2 mM glutamin,% 1 antibiyotik Pen / Strep ve% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ihtiva eden (yüksek glukoz, 4500 mg / L) içinde hücreler büyür. Bir 10 cm plaka normalde 01:03 de bölünmüş olmalıdır ve medya her iki günde bir, taze desteklenmiştir. </li><li> Tryps ile hafif hücre tedavisi01:01 tarif edildiği gibi DMEM ortamı içinde tekrar süspansiyon ve 1x. </li><li> Bir hemositometre odasında hücreleri saymak ve ayrı bir tüpe 3 x 10 6 hücre toplamak. </li><li> 5 dakika boyunca 100 g bir sallanan kepçeli rotor içinde santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın ve steril fosfat tamponu 2x ile hücre pelet yıkayın. </li><li> Immüno-farelerin sol ventrikül içine enjeksiyon için 10 6/50 ul bir konsantrasyonda PBS 1x süspanse edin. </li></ol> 2. Cerrahi öncesi Koşullar <ol><li> Her ameliyat öncesi, sıcaklık kontrollü bir izolatör steril gıda pelet ve su (Tablo 1, 22 ° C) ile immüno-fareler (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) koruyun. </li><li> Laminer akış kaputu altında immüno farelerin ameliyat. % 70 Etanol ile çalışma alanı temizleyin ve cerrahi aletleri (forseps ve makas) otoklav. </li><li> Cerrahi ve kurtarma için ısıtma pedleri açın. Isıtma yastıkları önemlidirsırasında meydana gelen vücut sıcaklığının azalma ve post-cerrahi engellemek için. </li><li> Kurtarma ısıtma yastığı temiz ve Otoklavlanmış kafes yerleştirin. </li><li> Izolatör steril bir otoklava torbaya ameliyat odasına orijinal kafeslerde fareler taşıyın. </li><li> Fare tartılır ve vücut ağırlığına göre enjekte deri altından (sc) ve medetomidin fare anestezi için% 0.9 steril tuzlu su çözeltisi içinde seyreltilmiş ketamin hidroklorür ihtiva eden bir çözelti, hem de (kas dinlenmek medetomidin 1 mg / kg ketamin hidroklorid 75 mg / kg). </li><li> Tam anestezi ne zaman (1-2 dakika içinde uyarıldıktan sonra hiçbir ayak tutam refleks) kafesinden fareyi çıkarın </li><li> Göğsünün sol tarafında epilasyon kremi ve boğaz alanı uygulayın. Zaman (yaklaşık 2-5 dakika) uygun bir miktar sonra, bir su-ıslak doku ile gevşek tüyleri silin. </li><li> Bir yatar pozisyonda ameliyat panelde fare yerleştirin. Itibarencerrahın bakış açısı konumu, dikey kuyruk aşağı kafa kadardır. </li><li> Arka bacak, deri altından içine steril tuzlu su çözeltisi (buprenorfin) seyreltilmiş 0.1-0.2 ug / g analjezik enjekte çözüm ve bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak aseptik çözüm povidon iyot ile traş alanı kapsamaktadır. </li><li> Boğaz alanında mikroskobu (2.5X nesnel) odaklanın. </li></ol> 3. Cerrahi Koşullar <ol><li> Künt makas biraz krikoid kıkırdak altında yaklaşık 0.5-1 cm uzunluğunda bir orta hat ventral cilt kesi yapmak ile. Tükürük bezleri görselleştirmek için bağ dokusu cilt ayırmak. </li><li> Aynı anda forcep ve manyetik göğüs ekartör ile her bir parçası hafifçe yana çekerek doğal orta hat bölünmesi tükürük bezleri bölmek ve trakea maruz. </li><li> Gırtlak maruz tarafına hafifçe dil çekin. Dikkatlice trakea içine entübasyon tüpü kaydırın. Tüp ucu görüntülenen l yoluyla görülebilirarynx ve nefes borusu. Tüp içinde, ancak açıkça görünür değilse önemlisi, bu yemek borusu bulunmaktadır. Çıkarın ve tüp ucunun konumunu değiştirmek. </li><li> Havalandırma makineye hortumunu. 200 ul ve 150 vuruş / dak inme ses seviyesini ayarlayın. Bir bant ile ameliyat panelde havalandırma hortumu sabitleyin. </li><li> Sol göğüs alana 1.5 cm uzunluğunda cilt kesi - künt makas ve forseps, 1 baş dikey kuyruk yapmak. </li><li> Kesiler yapmadan bağ doku / kas tabakaları ve majör ve minör göğüs kaslarının cildi gevşetin. </li><li> Aşağıdaki gibi, üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki torakotomi yapın: <ol><li> Kısma ve küçük, yuvarlak forseps ile kazıyarak interkostal kas tabakası delebilir. </li><li> Interkostal kas tabakası delikli sonra, maksimum göğüs boşluğu açmak için göğüs retraktör yerleştirin. Onun üstündeki kulak kepçesi (atrium) ile sol ventrikül (LV) üst ve orta parçalarışimdi görünür. </li></ol></li><li> Hücreleri ile hassas bir şırınga hazırlayın. Şırınga her bir enjeksiyon için 10 ul hacim içinde bir miktar vermek için gerekir. Şırınganın ucunda bir 30 G iğne Dökme. </li><li> Maruz iğnenin açık ucu dahil olmak üzere, sadece 1 mm bırakarak iğne bant (bir introcan-W 20 G), küçük plastik bir kanül ile tespit edin. Bu, tüm sol ventrikül duvarı delme ve sol karıncık boşluğuna hücreleri enjekte gelen iğne engelleyecektir. </li><li> (Her enjeksiyon enjekte edilen 106 hücre toplam 10 ul sunacak) 5X amaç yardımıyla, bu büyütme sol karıncık da görselleştirmek ve 5 farklı yerlerde, sol ventrikül duvar hücreleri enjekte edilir. Enjeksiyon başarılı olursa, beyaz bir alan ve hücrelerin büyük geri iletim yokluğu (enjeksiyon başarılı değilse, hayvan fonksiyonel analiz dışında olacaktır) görünür olacaktır. </li><li> Ekartörünü çıkarın. Göğüs duvarı b kapatıny 6-0 ipek sütür iki dikiş ile iki ayrılmış kaburga iliştirilen. </li><li> Göğüs kasları ve PBS 1x içinde boğulmuş bir ucu pamuklu cildi nemlendirmek ve yavaşça geri forseps ile orijinal konumuna kas koymak. </li><li> 6-0 ipek sütür 3-4 dikiş ile cilt kapatın. Cilt kapatmak için 2-3 dikiş ile boğaz kesi dikin. </li><li> Anestetik etkileri dönmek için atipamezol (1 mg / kg nihai konsantrasyon) enjekte edilir. </li><li> Fare özerk solunum başladığında kısa sürede, trakea tüpü çıkarmak ve sağ tarafı üzerine fare koymak. Fare dakika içinde kurtarmak bekleniyor. </li><li> Fare açmak ve yürümek, bir saat için sıcak kurtarma kafesi (kapalı süzülür üstüne küçük IVC kafes) yerleştirmek için başlar. </li><li> Kontrollü ısıtmalı kutu (37 ° C), gece boyunca hayvanlar bırakın. </li><li> Ameliyat sonrası ilk 2 gün boyunca toparlanmayı desteklemek için su ve pelet gıda ile bir çanak doldurun. </li></ol> Aşağıdaki gibi hücreleri ve 10 kontrol enjekte değil kalpleri ile enjekte On kalpleri histolojik analiz edilmektedir: <ol><li> 1 hafta enjeksiyonu (Şekil 1 ve 3) &#39;den sonra aşılanmış hücre analizi yapın. <ol><li> Izofluran doz aşımı ile ötenazi sonra, doku düzeltmek için% 4 paraformaldehid (PFA) 20 ml ile kalpleri serpmek. (% 70-100 den) etanol yüzdeleri artan ve parafin bloklar gömmek de sabit doku dehydrate. </li><li> Bölüm morfolojik analizler için hematoksilin ve eosin ile 5 um ve leke bir mikrotom ile parafine kalpler. </li><li> Masson Trichrom leke kullanarak bağ dokusu gözünüzde canlandırın. </li><li> Bir slayt tarayıcı mikroskop (Şekil 1A, 2A, 3A, 3B, 3C ve) altında görüntüleri analiz ve dijital slayt tarayıcı mikroskobu (Figu kullanarak kısa eksen görünümde tüm kalp görselleştirmekres 1B ve 1C). </li></ol></li><li> Yukarıdaki analizler, ksilen içinde kalp dokuları deparaffinize sonra, etanol içinde yüzde azaltmada örnekler daldırarak (% 100 su için) ve Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) için proses aşağıdaki gibi göre rehidrate: <ol><li> 1 saat boyunca 0.1 M fosfat tamponu içinde% 1 tannik asit ile deparafinize blokları inkübe edin. </li><li> (25-100% &#39;dan itibaren) etanol yüzdesi artan örnekleri kurutmak. </li><li> HMDS (heksametildisilazan) ile Kuru örnekleri. </li><li> Acheson Gümüş dağı ve altın-paladyum ile kaplamak onlara ile Stubbs üzerinde örnekleri monte edin. </li><li> Analitik bir taramalı elektron mikroskobu (Şekil 2B) View örnekler. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, kemirgen kalbimizde hücrelerin intramiyokardiyal enjeksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermiştir. Bu metodolojinin bir kanıtı olarak, biz HEK293 hücreleri kullanılmıştır. Bu HEK293 hücreleri herhangi bir hücre tedavisi çalışmada kullanılan ve bu nedenle bu yazının bulguları bir tedavi yaklaşımı doğrudan çeviri için uygun değillerdir olduğunu vurgulamak önemlidir. Bununla birlikte, HEK293 hücreleri kasılma hücreleri değildir ve diğer hücre tiplerinde transdifferentiate...

Çeşitli hücre dağıtım protokoller, insan hastalarda, bu deneysel prosedürün verimliliği, etkinlik ve güvenlik çeviri amacıyla kalp ve damar hastalıkları, murin ve sıçan modellerinde test edilmiştir. Sıçan kalbi 3 antegrad ve retrograd 4 intrakoroner hücre infüzyonu olarak da kullanılabilir ise küçük bir kemirgen kalplerde, intrakardiyak, hücre dağıtım, hücre teslim 1,2 en uygun yöntemdir. Her iki yöntem sınırları ve avantajları var. İntrakoroner yolla hücre teslim küresel cep yayılmasını 3 teşvik doğrudan kas içine enjeksiyon üzerinde teorik avantajları vardır, ama aynı zamanda koroner emboli, 3,5 neden riski vardır. Intramiyokardiyal teslim Sınırlamalar mekanik yaralanma, akut inflamasyon, ve miyokard hasarı 6,7 ile ilişkilidir. İnsanlarda, kalp onarım için hücreler, endokardiyal veya cerrahi epikardiyal yoluyla intrakardiyak enjeksiyonu ile teslim ediliryaklaşım ya da İntrakoroner arter yol 8 ile. Transvasküler yollardan enjeksiyon akut enfarktüs ve reperfüzyon miyokardiyumda hastalarda uygundur, ancak toplam örtme ya etkilenen topraklarının 9 damarlar içinde yoksul akış durumunda mümkün olmayabilir. Transendocardial veya transepicardial enjeksiyon ile ventriküler duvarın içine direkt enjeksiyon, hastanın sağlık durumu ile ilgili olarak teknik olarak mümkün değildir. Gerçekten de, bu transepicardial enjeksiyon için bir açık göğüs cerrahi gereklidir ve transendocardial için uygun bir işemik ya da yaralı miyokard 9 siteleri ayırt etmek için gerekli olan her bir hasta için bir elektrofizyolojik eşleme yaklaşımlar her ne kadar bu teknik, 10,11 güvenli olduğu gösterilmiştir. Önemlisi, hücre tedavisi çalışmalarında nakledilen iyi hücrenin seçimi halen araştırılmaktadır. Kısa vadeli analizleri (4 hafta) gösterdi ki cardiospheres olarak tanımlanan kardiyak kök hücre enjeksiyonu <skadar&gt; 12 veya kemik iliğinden 13 yan nüfus hücreleri yara boyutu ve hücre ölümünü azaltarak enfarktüsteki kemirgen 14 ve sıçan 15 modellerinde kardiyak fonksiyonel iyileşme kaynaklı. Immünosupresyonun olmadan bir sıçan miyokard enfarktüsü modelinde cardiospheres arasında allojenik transplantasyon kardiyak rejenerasyon terfi, güvenli bulundu, ve endojen tamir mekanizmalarının 15 uyarılması ile kalp fonksiyonları geliştirildi. Kalbinde Lin-/c-kit + yetişkin projenitör hücrelerin in vitro ve in vivo olarak kendini yenileyen, klonojenik ve multipotent olduğu gösterilmiştir ve bir işemik sıçan kalbi enjekte edildiğinde yaralı miyokard duvar 16 arasında büyük bir kısmı yeniden kurulmuş ve vardı iletken ve orta ölçekli koroner arterleri 17 oluşturmak için yeteneği. Bu umut veren veriler faz yakıtlı I ve II, insanlarda klinik çalışmalar: otolog ve allojeneik mezenkimal kök hücreler (MSC) 18 enjeksiyonu, 19, cardiospheresYa da c-Kit pozitif kardiyak kök hücreler (CSC) iskemik insan gönlünde her 20 uzun dönemli çalışmalarda kalp fonksiyonunda yararlı etkileri olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, geniş kapsamlı, uzun süreli izlem ve retrospektif meta-analiz kök hücre tedavisi değil, öngörülemeyen sonuçları 21 bir dizi ile diğerleri, bazı hastalar için önemli fayda sağladığını göstermiştir. Bu sınırlamalar, her birey ve her bir hastalık için hücre teslimat özel protokoller tasarımını gerektirecek olasıdır. Fare ve sıçan modellerinde, uzun vadeli çalışmalar hücre enjeksiyonu ayrıca kalp fonksiyonunu (12 ay) düzelmedi ortaya koymuştur. Gerçekten de, insan embriyonik kök hücre türetilmiş kardiyomiyositler (HESC-CM) greft ölçüde fibrotik doku 22,23 tabakasıyla ana miyokardiyumundan izole edilmiştir. Benzer sonuçlar Enfarktüslü farelerin 24 kalbine iskelet miyoblastların intramiyokardiyal naklinden sonra gözlenmiştir. Furthermo, yeniden enfarktüslü kalp fonksiyonunu korumak için allojeneik MSC nin uzun vadeli yeteneği farklılaşması 25 sonra bir imünojenik durumuna bir immunoprivileged geçiş ile sınırlı kalmıştır. Dikkate yukarıda özetlenen sorunlar ve beklentileri dikkate alarak, biz farelerde intramiyokardiyal enjeksiyon yoluyla hücreleri sunmak için burada nasıl göstereceğim. Biz kardiyomyosit kasılma özelliğinin olmadan hücrelerin konak miyokardın ile bağlı ve ince fibrotik bariyer ile kaynaşmış bir kütle oluşturmak olmadığını gözlemlemek. Bazı durumlarda bu sonuç avantajlı olabilir, aşağıdaki analiz hücre nakli de işlevsel olarak bağlantılı miyokard yapıları oluşturmak için modüle edilebilir anlamak için yararlı olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="560">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Isolator</td>
			<td style="width:115px;">Pfi systems</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Quotation needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:115px;">Vet Tech Solutions</td>
			<td style="width:88px;">HE006</td>
			<td style="width:255px;">For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">medetomidine</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">atipamezole</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Commercial shops</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">NVS</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Leica MZFLIII microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;">Model S6E</td>
			<td style="width:255px;">With swing arm stand TS0</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:103px;">Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner</td>
			<td style="width:115px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:88px;">RS series</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Jeol</td>
			<td style="width:88px;">JSM-6610</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Blunt scissors</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">14084-09</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Minivent</td>
			<td style="width:115px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:88px;">73-0043</td>
			<td style="width:255px;">Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Forceps</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">11052-10</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Retraction system</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">18200-20</td>
			<td style="width:255px;">Kit for animals up to 200grams</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">30G 12mm; &#189; inch</td>
			<td style="width:115px;">BBraun</td>
			<td style="width:88px;">A210</td>
			<td style="width:255px;">Fine yellow</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">microliter syringe</td>
			<td style="width:115px;">ESSLAB</td>
			<td style="width:88px;">81201</td>
			<td style="width:255px;">Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">6-0 silk suture</td>
			<td style="width:115px;">Ethicon</td>
			<td style="width:88px;">W1614T</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts

Önceki çalışmalar, hücre teslim sitokinler ve kardiyak doku revaskülarizasyon ve hücre sağ kalımı arttırmak faktörlerin salınımı ile kardiyak fonksiyon düzelmesini teşvik ettiğini gösterdi. Buna ek olarak, bundan başka gözlemler kardiyak kök hücreler, mezenkimal kök hücreleri ve cardiospheres gibi belirli kök hücreler, kardiyomiyositler, yumuşak kas hücreleri ve endotel hücrelerine diferansiyel çevredeki miyokard içinde entegre yeteneğine sahip olduğunu ortaya koydu. Burada, güvenli bir immüno-farelerin sol ventrikül duvar içine kontraktil olmayan hücreler sağlamak için malzeme ve yöntemler sunar. Bu mikrocerrahi prosedürün belirgin adımlar anestezi ve analjezi enjeksiyon, entübasyon, göğüs açık ve steril 30-gauge iğne ve hassas bir mikrolitre şırınga ile hücrelerin kalp ve teslim maruz kesi içerir. Kalp hasat, embeddi oluşan doku işlemeng, kesit ve histolojik boyama intramiyokardiyal hücre enjeksiyonu küçük bir epikardiyal alanında hasar, hem de ventrikül duvarında ürettiğini göstermiştir. Kontraktil olmayan immün hücreler, farelerin miyokard duvarına muhafaza edildi ve kalp basıncı ve mekanik yükten koruma muhtemel fibrotik doku tabakasıyla çevrili edilmiştir.

Biz, ince uzun kardiyomiyositlerde (Şekil 1A) ile karşılaştırıldığında bir parke taşı şekli ile (Şekil 1) en farklı morfoloji ile kalp hücrelerden ayırt edilebilir HEK293 hücreleri, enjekte edildi. HEK293 hücreleri nedeniyle artan nükleer içeriği (Şekil 1A) muhtemel kardiyomiyositlerin (pembe renkli), karşılaştırıldığında hematoksilen boya (mavi renk) daha reaktif edildi. Bundan başka, ana doku enjekte hücreleri ayırt etmek için, HEK293...

Watch this Scientific Journal Video about Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts at JoVE.com

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Hipertansiyon ya da miyokart enfarktüsü gibi kalp-damar hastalıkları, kemirgen modellerinde intramiyokardiyal hücre dağıtım yaygın rejeneratif çalışmalarda farklı hücre tiplerinin terapötik potansiyelini test etmek için kullanılır. Bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama ve bu cerrahi işlemin açık bir görselleştirme küçük kemirgenler kardiyovasküler hücre tedavi analizlerin sınırlarını ve avantajlarını tanımlamak için yardımcı olacaktır.

Intramiyokardiyal Hücre Teslimat: Mürin Hearts Gözlemler

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

intramyocardial-cell-delivery-observations-in-murine-hearts

Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K Görüntüleme.  Imperial College London.  Hipertansiyon ya da miyokart enfarktüsü gibi kalp-damar hastalıkları, kemirgen modellerinde intramiyokardiyal hücre dağıtım yaygın rejeneratif çalışmalarda farklı hücre tiplerinin terapötik potansiyelini test etmek için kullanılır. Bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama ve bu cerrahi işlemin açık bir görselleştirme küçük kemirgenler kardiyovasküler hücre tedavi analizlerin sınırlarını ve avantajlarını tanımlamak için yardımcı olacak...

Video: Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Enfarktüsü bir murin Model Koroner Arter ligasyon ve intramiyokardiyal Enjeksiyon

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Tıp

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Algisyl-LVR kullanarak Hearts başarısız Fonksiyon Sol Ventrikül Duvar Stres ve İyileştirme azalma

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Farelerde ultrason eşliğinde transtorasik intramiyokardiyal Enjeksiyon

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Perkütan kontrast Ekokardiyografi güdümlü Intramyocardial enjeksiyon ve hücre teslim büyük preklinik modeli

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Periadventitial Terapötik Uygulama ile Sıçan Karotis Arter Basınç Kontrollü Segmental Balon Yaralanması

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

Fizyolojik Koşullar altında Domuz Kalpleri Dilimleme ve Culturing

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper introduces a noninvasive method of intratracheal delivery of dry powder formulation in mice. A dry powder loading device that consists of a 200 &#181;L gel loading pipette tip connected to an 1 mL syringe via a three-way stopcock is presented. A small amount of dry powder (1-2 mg) is loaded into the pipette tip and dispersed by 0.6 mL of air in the syringe. Because pipette tips are disposable and inexpensive, different dry powder formulations can be loaded into different tips in advance. Various formulations can be evaluated in the same animal experiment without device cleaning and dose refilling, thereby saving time and eliminating the risk of cross-contamination from residual powder. The extent of powder dispersion can be inspected by the amount of powder remaining in the pipette tip. A protocol of intubation in mouse with a custom-made light source and a guiding cannula is included. Proper intubation is one of the key factors that influences the intratracheal delivery of dry powder formulation to the deep lung region of the mouse.

Dry powder formulations for inhalation have great potential in treating respiratory diseases. Before entering human studies, it is necessary to evaluate the efficacy of the dry powder formulation in preclinical studies. A simple and noninvasive method of the administration of dry powder in mice through the intratracheal route is presented.

Farelerde Kuru Toz Formülasyonunun Intratrakial Yönetimi

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

Bir Murine Modelinde İskemi Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Kök Hücrelerin Gecikmiş İntramiyokardiyal Teslimi

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Murine Modelinde Miyokard İnfarktüsünden Sonra MSC Yüklemeli Enjekte Edilebilir Hidrojellerin intramiyokardiyal Transplantasyonu

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...