이 프로토콜은 지역 생체 역학, 조직 아키텍처, 파라크리인 환경 및 병스타크린 상호 작용의 변경이 세포 표현형에 미치는 영향을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 우리가 전통적인 그래프 실험에서 일반적으로 생기는 대규모 조직 모욕을 일으키는 원인이 되지 않고 고전적인 패러다임 및 실험적인 배아학을 탐구하는 것을 허용합니다. 주입에 대 한 오른쪽 압력을 찾기 위해, 그것은 낮은 주입 압력에서 시작 하 고 세포의 꾸준한 흐름이 달성 될 때까지 점진적으로 증가 하는 것이 도움이.
이 기술을 시각화하면 사출 장비가 대상 조직과 관련하여 배치되어야하는 방법을 직접 이해하는 데 도움이됩니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 두 구성원, 트레버 헨리와 칸디스 토마스가 될 것입니다. 이식 24시간 전에 표준 프로토콜에 따라 마이크로 피펫 풀러에 유리 모세혈관을 당기고 모세혈관을 실리콘화제에 찍어 바늘의 외부 표면을 코팅합니다.
다음으로, 실리콘화제 의 5~10마이크로리터를 마이크로주입 파이펫 팁에 적재하고 외부코팅 유리 모세관의 넓은 끝에 팁을 놓습니다. 파이펫 팁을 가능한 한 유리 바늘 팁에 가깝게 배치하고 실리콘 제를 배출하면서 바늘 내의 기포를 최소화하기 위해 로딩 파이펫을 천천히 철회합니다. 새로운 로딩 파이펫을 사용하여 용액을 흡인하기 전에 실리콘제를 유리 바늘에 10분 간 둡니다.
그런 다음 밤새 연기 후드에 바늘을 건조. 숙주 배아 준비를 위해 비옥한 닭 알을 38도의 가습 된 인큐베이터에서 수평 방향으로 배양하고 각진 집게를 사용하여 계란 적도를 따라 각 계란의 평평한 끝의 바닥에 1 밀리미터 직경의 구멍을 만듭니다. 10 밀리리터 주사기에 부착된 18게이지 바늘을 천자에 삽입하여 약 5밀리리터의 알부민을 제거합니다.
그리고 계란 껍질의 상단에 투명 테이프를 적용합니다. 각진 집게로 계란의 상단을 따라 테이핑 된 영역을 점수와 계란의 테이핑 섹션에서 약 2.5 센티미터 창을 잘라 곡선 된 동판 기법 가위를 사용합니다. 햄버거와 해밀턴에 의해 수립 된 기준에 따라 배아를 검사하고 단계및 배아 아래 HBSS에서 인도 잉크의 1 ~ 5 희석의 약 200 마이크로 리터를 주입하는 32 게이지 바늘을 장착 한 1 밀리미터 주사기를 사용합니다.
그런 다음 투명 테이프로 펑크를 밀봉하고 가습 된 인큐베이터에 다시 계란을 배치하기 위해 파라핀 필름으로 창 껍질을 밀봉하기 전에 배아 디스크에 HBSS 드롭 와이즈 1 밀리리터를 추가합니다. 배아가 햄버거와 해밀턴 19단계에 도달하면 실리콘 코팅 유리 모세혈관을 탈온화된 물로 헹구고 모세혈관이 실온에서 3~4시간 동안 건조되도록 합니다. 평균 시간에, 멸균 실온 HBSS를 포함하는 100 에 15 밀리미터 페트리 접시에 한 계란에서 배아를 전송하고 스테레오 현미경 아래에 접시를 배치합니다.
집게, 독토미 가위 및 마이크로 주걱을 사용하여 배아 심장 전체를 배아에서 분리하고 심장에서 아리아를 격리시합니다. 심방 조직을 멸균 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 얼음 에 HBSS 1밀리리터를 함유합니다. 모든 기증자 조직이 수집되었을 때, 고정 된 각진 미세 원심 분리기에서 원심 분리에 의해 조직을 펠릿.
기증자 조직 소화를 위해, 분당 300 회전에서 흔들리는 열 블록에서 15 분 동안 사전 따뜻하게 05 %의 트립신 EDTA의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하십시오. 인큐베이션의 끝에서, 파이펫 소화 용액은 남은 조직을 분해하고 심장 이슬을 원심분리에 의해 펠릿. 또 다른 원심분리를 위한 트립신 중화 용액의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단한 다음 적색 형광 염료 용액의 400 마이크로리터에서 재서스펜션을 수행한다.
섭씨 37도에서 20분 후, 세척당 HBSS 1밀리리터에서 1~3회 세척을 위해 세포를 원심분리하여 환원분리합니다. 그런 다음 신선한 HBSS에서 마이크로리터 농도당 제4 세포에 5회 10시에 표지된 세포를 다시 중단한다. 기증자 세포의 생체 내 주입을 위해, 세포 현탁액을 건조하고 실리콘 처리된 유리 모세관 파이펫으로 역로드하고 압력 마이크로인젝터 장치에 파이펫을 장착한다.
가습된 인큐베이터에서 주입되는 각 숙주 배아를 형광 스테레오 해부 현미경하에서 계란 홀더로 이송한다. 그리고 멸균 미세 집게를 사용하여 진동 막을 엽니 다. 심낭에서 5~1밀리미터 절개를 하고 마이크로주입기의 끝이 표적 조직에 침투하도록 배치한다.
마이크로인젝터를 설정하여 지속 시간 5초의 단일 펄스를 적용하고 압력에서 100에서 400 사이의 헤코토퍼스칼에 이르기까지 다양합니다. 그리고 세포를 압력 주입. 계란을 재밀봉하기 전에 형광 신호를 이미징하여 성공적인 세포 이식을 확인하는 것이 중요합니다.
배아는 또한 이 절차를 문서화하기 위하여 촬영될 수 있습니다. 모든 세포가 주입되면 마이크로 인젝터 장치를 철회하고 홀더에서 계란을 제거하십시오. 그런 다음 따뜻한 HBSS 드롭 와이즈1 밀리리터를 배아에 추가합니다.
투명 포장 테이프로 달걀을 밀봉하고 이식 후 24 시간 동안 가습 된 인큐베이터로 계란을 반환합니다. 여기서, 기증자 심방 심근세포 이식 후 숙주 배아 심장의 심장 및 주변 조직이 나타난다. 이러한 대표적인 실험에서, 기증자 세포는 유사한 단계의 숙주 배아의 프로피카듐내로 마이크로주입되었다.
공초점 현미경을 이용한 광학 단면은 프로피카르듐 내의 유일한 심장 근육 마커 양성 세포가 초점하게 이식된 형광적 적양성 세포였다는 것을 밝혔다. 주사 바늘에 의한 심장및 국소 혈관통의 파열로 수신자 배아를 과도하게 조작하지 않으면 생존가능성이 저하될 수 있습니다. 이 절차에 이어, 면역학화학을 포함한 다양한 다운스트림 분석이 시상 혼성화 및 세포 분류에서 수행될 수 있다.
실리콘 제는 매우 인화성 및 급성 독성입니다. 그것은 항상 연기 후드 내부에주의하고 적절한 개인 보호 장비로 처리해야합니다.
