Biz Shlomi Krispin nöral tüp görüntü için teşekkür ederiz. Özellikle, GFP transfeksiyon tekniği başlatmak için Yuval Tarçın kabul etmiş sayılırsınız. Bu çalışma, CK, İsrail Bilim Vakfı, Derneği Francaise contre les Miyopatiler, ve Deutche Forschungsgemeinshaft Arastırma Merkezi 488 hibe tarafından desteklenen

1. Mikropipetler hazırlanması Biz, bir ısı ayarı ile 13.5 standart Narishige pp-83 pipet çektirmesi pipetler çekin. Hassas ayar bir pipet ucu çapı 8 ila 10 mikron amaçlayan, kalibre edilmesi gerekir. Filament içeren bir dış çapı 1.0 mm ve iç çapı 0,75-0,78 mm ile borosilikat cam tüpler kullanır. Pipetler, plastik bir tabak çanağın kenarları ile temas korunan ipuçları dolayısıyla saklanır. 2. DNA hazırlığı Ilgi plazmid DH5α E. transfekte standart prosedürler kullanarak coli. Gecelik kültürlerin tek koloniler plazmid kullanarak maxi-hazırlık setleri (herhangi bir ticari kit yapmalıyım) arındırmak için kullanılır. Biz, 1.0 mg / ml-klonal olmayan enjeksiyonlar için bir plazmid konsantrasyon kullanın. Yüksek konsantrasyonlarda pipet uçları tıkanma artırmak. Klonal uygulamalar için, plazmid konsantrasyonları çok düşüktür ve ayarlanabilir olmalıdır (aşağıya bakın). PCAGG-GFP, klonal sonuçlar üreten optimal konsantrasyonu yaklaşık 0.05-0.1 mcg / ml olarak bulundu. Plazmid biri 2 mcL genellikle Deneme başına kullanılır, deney başlamadan önce en az bir fast-yeşil toz miktarı (kuru, keskin cam pipet ucu bağlı kalarak) plazmid eklenir. Plazmid sonra, 2 dakika süreyle maksimum hızda bir masaüstü santrifüj santrifüj. Bu prosedür, pipet tıkanma sorunları azaltmak için gibi görünüyor. 3. Embriyoların Enjeksiyon 3.1 Hazırlık embriyoların Biz enjeksiyon için bıldırcın yanı sıra tavuk yumurtası kullanın. Yumurtalar istenilen gelişim aşamasına kadar uzun ekseni üzerinde yatarken inkübe edilir. Yumurta% 70 etanol ile temizlenmesi ve kuruması için izin verilir. Yumurtanın sivri ucu cerrahi makas (bu sadece tavuk yumurtası gerekli) ve 1 ml (bıldırcın) ya da 10 ml şırınga ile (19G iğne), yumurta çekilir akı, 2 ml (civciv) ile deldi. Delikler daha sonra sıcak parafin ile mühürlenir. Gerçek enjeksiyon öncesinde, cerrahi makas kullanarak yumurta kabuğunun üst kısmında bir pencere açıldı. Kabuk üzerindeki yapışkan bandı yerleştirilmesi ve bunun üzerinden kesme, kabuk enkaz azaltmaya yardımcı olabilir. Antibiyotik içeren PBS yumurtanın içine hemen pipetlenir. Embriyo erişmek için, vitellin ve / veya amniyotik membranlar kesilir ve bir iğne tutucu üzerine monte 0.14 mm böcek pimleri kullanılarak yönlendirilir. Toksik olmayan mürekkep (Pelican # 17) kullanılarak, embriyo görselleştirmek yardımcı olmak için blastodermin altına enjekte edilir bir aspiratör monte kapiller yangın çıkardı. 3.2 mikropipetler yükleme ve montaj Plazmid, çektirmesi mikropipetler bir aspiratör üzerine monte edilmiş, yeterli çaplı yangın çekti kılcal damarlar tarafından yüklenebilir. Az miktarda plazmid bir açılış tersi bilenmiş ucu pipet içine kılcal ve yüklü kullanarak ve mümkün olduğu kadar içeriden ucu yaklaşırken çizilir. Pipet enjektör bir micromanipulator üzerine monte edilmiş bir manuel hava basıncı dolayısıyla yüklenir. Minimum basınç pipet ucu ulaşmak için plazmid çözüm sağlamak amacıyla, gerektiğinde uygulanır. 3.3 Plazmid enjeksiyon Pipet, pipet tıkanmasını önlemek için bazı hava basıncı uygulayarak, yumurta sıvı ortama manipüle. Ilgili doku etki deldi. Ucu doku girerken basınç değişim genellikle görünür hızlı yeşil plazmid serbest bırakmak için yeterli. Bu durumda değilse, hızlı / plazmid yeşil çıkarılana kadar, şırınga hafif basınç uygulayın. Bu süreç, komşu Somitlerin örneğin ya da nöral tüp ölçüde boyunca, embriyonun ekseni boyunca tekrar edilebilir. Enjeksiyonları takiben, PBS ilave edilebilir. Parafilm özellikle bıldırcın için arzu edilen yumurta kabuk yoluyla oksijen alışverişini engelleyerek muhtemelen, embriyo ölüm oranlarını artıran bir yapışkan bant kullanarak pencere kapatılır. Tedavi edilen embriyoların bir kuluçka iade edilir. Havalandırma kaçının ve nem ve artış verimleri korumaya yardımcı inkübatör su ile küçük kaplar. 4. Enjeksiyon Parametrelerin ayarlanması ve Başarı Oranları İzlenmesi Asessing ve çeşitli enjeksiyon parametreleri kalibre tek hücreli analiz amaçlayan uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Her enjeksiyon olay değil, tek bir hücre başarılı bir şekilde etiketlenmesine neden olacaktır. Plazmid konsantrasyonu çok yüksek, yüksek başarısızlık oranları çok düşük konsantrasyonlarda ise non-klonal etiketleme yol açabilir. Klonal enjeksiyonları enjekte edilen plazmid konsantrasyon için optimize edilmiş olmalıdır. Biz tüm saflaştırılmış plazmid stok seyreltme yerine, önceden belirlenmiş bir konsantrasyon bireysel preparatlarıyla seyreltilmesi önerilir. İkincisisaflık ve supercoiled plazmid oranı gibi diğer parametreler farklılıklar nedeniyle büyük olasılıkla başarı oranları, bazı varyans tanıtmak olabilir. 4.1 bütün montaj gözlem ile başarı oranları değerlendirilmesi Floresan bir binoküler altında bütün montaj gözlem tarafından enjekte edilen embriyoların İlk değerlendirme yapılabilir. Enjeksiyon sonrası altı ila sekiz saat pCAGG geliştirilmiş bir GFP inşa başarı oranlarını değerlendirmek için yeterli. Bu hedef siteye kolayca görünür olmak için yeterli yüzeysel (örneğin dorsal hücre gruplarının, dorsal nöral tüp, ektoderm vb, Şekil 1A-C bakın.) Sağlanır. Bu adım çok sayıda etiketli hücreleri veya alternatif olarak, herhangi bir flüoresan hücreleri eksik ya sergileyen deneysel serisi değerlendirmek için yararlıdır. Daha fazla inkübasyon isteniyorsa, antibiyotik içeren PBS çözüm görüntüledikten sonra yumurta eklenir ve sızdırmazlık bandı değiştirilmesi gerekir. 4.2 seri kesit analizi ile değerlendirilmesi klonalite Enjekte edilen embriyolar seri-kesit ve etiketli hücreleri görselleştirmek için immünhistokimya kullanarak başarılı enjeksiyonları oranlarını değerlendirmek için en iyi yol. Bu koşullar altında, kuluçka süresi, enjeksiyon sonrası 4 saat kadar kısa olabilir. Embriyolar sabit ve parafin kesit (ya da cryosectioning) işlenir. Cam monte bölümleri de paraffinized ve muhabir görünüm için immüno-lekeli. Çoğaltma yöntemleri gibi biotin streptavidin gibi arzu olabilir. Son olarak, seri bölümler etiketli hücreleri enjekte segmentleri algılamak için taranır. Tek hücre yerine birden fazla elde edilen ilk denemeleri üzerine, plazmid stok seyreltilmiş olmalı ve yeterli sonuçlar elde kadar işlem tekrarlanır. Plazmid stok solüsyonu İki ila 10 kat dilüsyonlarının başarı oranları çok yüksek olan durumlarda gerekli olabilir. Plazmid transfekte olması için, klonalite sağlayan kapsamlı kalibrasyon tekrar edilmelidir. 5. Temsilcisi Sonuçlar Embriyo 1 2 başına 6-12 segmentleri hedef alırken genellikle, tek bir enjeksiyon hücre gruplarının ortalama pCAGG-GFP yürütmek. Bu ayarı altında, açık bir sinyal en az bir on bir embriyo segmentinde tüm montaj gözlem 8 saat enjeksiyon tarafından tespit edilebilir. Bu koşullar altında, etiketleme daha klonal (Şekil 1B, C) olarak teyit edilmiştir. Yüksek DNA konsantrasyonları kullanırken, birden fazla hücreyi transfekte olduğunu olasılığını artıran en embriyolar, en az bir başarılı bir enjeksiyon gösterebilir. Seri bölüm analizi başarı oranı yaklaşık% 10 iken klonal transfections ulaşılmıştır saptandı. Bu klonalite ulaşmak için, teknik, tanım başına son derece verimsiz olduğunu anlamına gelir. Öte yandan, bu koşullar altında, olumlu etiketleme olayların% 93 daha fazla klonal 1 bulundu. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Sinir ve iskelet atalarıdır içine pCAGGS-GFP Klon enjeksiyonları dorsal nöral tüp etiketleme (NT) (A), dermomyotome (DM) (B) ventrolateral etki alanı veya merkezi DM levha (C) gösteren (AC) Enine bölümleri , tek bir progenitör pCAGGS-GFP mikroenjeksiyon sonrası 6hr. (D), dermis (D) yanı sıra kas (M) (ref bakın. Ayrıntılar için 1) türevleri oluşturulan merkezi DM, tek atalarıdır klonal transfeksiyon takip eden iki gün.

<ol>
	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

Yukarıda açıklanan yöntem, küçük hücre alt grupları veya tek atalarıdır 3 lipofilik boyalarla teslim için önceden açıklanan teknik bir değişiklik . Bu standart elektroporasyon tekniği üzerinde üç ana avantajı vardır. İlk olarak, elektroporasyon daha yüksek uzaysal çözünürlük (C, örneğin Şekil 1B) sağlayan, hedef dokular olan güveni ayrık siteleri ile etiketlenmesi için bir araç sağlar. İkincisi, bu nedenle, normal koşullar 1 2 (Şekil 1C, D) altında in<...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

Gelişimsel biyoloji merkezi bir tema soyları çeşitlendirilmesi ve altta yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması. Bu normal ve deneysel koşullar altında tek hücre kaderi ayrıntılı bir analiz gerektirir. Bu amaçla, tek atalarıdır hedef transfeksiyon yöntemleri bir önkoşuldur. Biz burada, yanı sıra genetik manipülasyon izleme güvenilir soyu, tavuk-ovo dokuların tek hücre transfecting sağlayan bir teknik olarak basit bir yöntem açıklanmaktadır. Özgül doku etki hücre gruplarının ya da nöral tüp içinde hedeflenen ve DNA tek hücre sporadik transfeksiyon ilgi epitel içine doğrudan enjekte edilir. Gazetecilere kullanarak klonal popülasyonları dolayısıyla üç gün için takip edilebilir ve genetik olarak manipüle klonal popülasyonlarının davranış kontrolleri ile mukayese edilebilir. Bu yöntem, genetik manipülasyon için yeni araçlar ile birlikte civciv embriyo erişilebilirlik yararlanır. Biz karşılaştırın ve yaygın olarak kullanılan elektroporasyon yöntemi daha fazla avantaj ve olası uygulamaları tartışmak ve ek in vivo modellerde de önerilmektedir. Biz mevcut soy izleme ve genetik etkileşim araçları için önemli bir ek ve tamamlayıcı olarak bu yöntemin kullanılmasını savunan.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Transfection in Chick Embryos at JoVE.com

Single Cell Transfection in Chick Embryos

Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.

Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Görüntüleme.  Hadassah Medical School - Hebrew University. Ince ucunu kullanarak, biz, tavuk Somitlerin veya sinir tüpleri alt etki alanlarını içine plazmid DNA enjekte mikropipetler. Plazmid konsantrasyonu tek transfekte hücreler oluşturmak için ayarlanır. Daha sonra hücreler klonal popülasyonları dönüşmesine izin verir.

Video: Single Cell Transfection in Chick Embryos

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biyoloji

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...