Este protocolo nos ajuda a determinar como alterações na biomecânica local, arquitetura tecidual, ambientes paracrinos e interações justacrinas influenciam o fenótipo celular. Essa técnica nos permite explorar paradigmas clássicos e embriologia experimental sem causar os insultos teciduais em larga escala que normalmente surgem em experimentos gráficos tradicionais. Para encontrar a pressão certa para a injeção, é útil começar com uma pressão de injeção mais baixa e aumentar gradualmente até que um fluxo constante de células seja alcançado.
Visualizar essa técnica ajuda a entender diretamente como o equipamento de injeção precisa ser posicionado em relação ao tecido alvo. Demonstrando o procedimento serão dois membros do meu laboratório, Trevor Henley e Kandace Thomas. 24 horas antes da implantação, puxe capilares de vidro em um puxador de micropipette de acordo com os protocolos padrão e mergulhe os capilares em agente de silício para revestir as superfícies externas das agulhas.
Em seguida, carregue de 5 a 10 microliters de agente de silício em uma ponta de pipeta de microinjeção e coloque a ponta na extremidade larga de um capilar de vidro puxado externamente revestido. Posicione a ponta da pipeta o mais perto possível da ponta da agulha de vidro e ejete o agente de silício enquanto retrai lentamente a pipeta de carregamento para minimizar as bolhas de ar dentro da agulha. Deixe o agente silício na agulha de vidro por 10 minutos antes de usar uma nova pipeta de carregamento para aspirar a solução.
Em seguida, seque as agulhas em um capô de fumaça durante a noite. Para a preparação do embrião hospedeiro, incubar ovos de galinha férteis em uma orientação horizontal em uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius e usar fórceps angulares para fazer uma punção de diâmetro maior que um milímetro na parte inferior da extremidade plana de cada ovo ao longo do equador do ovo. Insira uma agulha de calibre 18 presa a uma seringa de 10 mililitros na punção para remover cerca de cinco mililitros de albumen.
E aplique fita transparente no topo da casca de ovo. Marque a região colada ao longo da parte superior do ovo com fórceps angulares e use uma tesoura curva de tenotomia para cortar uma janela de aproximadamente 2,5 centímetros na seção colada do ovo. Inspecione e enseque o embrião com base nos critérios estabelecidos por Hamburger e Hamilton e use uma seringa de um milímetro equipada com uma agulha de calibre 32 para injetar cerca de 200 microliters de uma diluição de uma a cinco tintas da Índia no HBSS sob o embrião.
Em seguida, sele a punção com fita transparente e adicione um mililitro de HBSS em forma de gota no disco embrionário antes de selar a casca com filme de parafina para colocação do ovo de volta na incubadora umidificada. Quando os embriões chegarem ao Hambúrgueres e à etapa 19 de Hamilton, enxágue os capilares de vidro revestidos de silicone com água deionizada e deixe os capilares secarem por três a quatro horas em temperatura ambiente. Enquanto isso, transfira um embrião de um ovo para uma placa de Petri de 100 por 15 milímetros contendo HBSS de temperatura ambiente estéril e coloque a placa sob um microscópio estéreo.
Usando fórceps, uma tesoura de tenotomia e uma micro espátula, isole todo o coração embrionário do embrião e isole a atria do coração. Coloque o tecido atrial em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril contendo um mililitro de HBSS no gelo. Quando todo o tecido do doador tiver sido coletado, pelota os tecidos por centrifugação em uma microcentrifuagem angular fixa.
Para digestão de tecido do doador, suspenda as pelotas em um mililitro de edta de 05% de trippsina pré-aquecida para uma incubação de 15 minutos em um bloco de calor tremendo a 300 rotações por minuto. No final da incubação, pipeta a solução de digestão várias vezes para quebrar qualquer tecido restante e pelotas o lysate cardíaco por centrifugação. Suspenda a pelota em um mililitro de solução neutralizante de trippsina para outra centrifugação seguida de re-suspensão em 400 microliters de solução de corante fluorescente vermelho.
Após 20 minutos a 37 graus Celsius, pelota as células por centrifugação para uma a três lavagens em um mililitro de HBSS por lavagem. Em seguida, suspenda novamente as células rotuladas em cinco vezes dez para as quartas células por concentração de microliter em HBSS fresco. Para injeção in vivo das células doadoras, recarregue a suspensão celular em uma pipeta capilar de vidro seca e tratada com silicone, como demonstrado e monte a pipeta no aparelho microinjetor de pressão.
Transfira cada embrião hospedeiro para ser injetado da incubadora umidificada em um suporte de ovo sob um microscópio de dissecação estéreo fluorescente. E use fórceps finos estéreis para abrir a membrana vitelline. Faça uma incisão de 5 a um milímetro no pericárdio e posicione o microinjetor de tal forma que a ponta da agulha de microinjeção penetra o tecido alvo.
Defina o microinjetor para aplicar pulsos únicos de 5 segundos de duração e variando de 100 a 400 hectopascals em pressão. E injetar pressão nas células. É fundamental verificar uma implantação celular bem sucedida através da imagem do sinal fluorescente antes de ressar o óvulo.
O embrião também pode ser fotografado para documentar este procedimento. Quando todas as células tiverem sido injetadas, retraia o aparelho microinjetor e remove o óvulo do suporte. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS quente em forma de gota no embrião.
Sele o ovo com fita adesiva transparente e devolva o ovo à incubadora umidificada por 24 horas após a implantação. Aqui, o coração e o tecido circundante de um coração embrionário hospedeiro após a implantação de mócito atrial doador é mostrado. Neste experimento representativo, as células doadoras foram microinjetadas no proepiácdio de um embrião hospedeiro de um estágio semelhante.
A seção óptica usando um microscópio confocal revelou que as únicas células positivas do marcador muscular cardíaco dentro do proepiácdio eram as células positivas vermelhas fluorescentes implantadas focalmente. Tome cuidado para não manipular demais o embrião receptor, pois rupturas no coração e vasculatura local causada pela agulha de injeção podem resultar em viabilidade reduzida. Após este procedimento, uma variedade de ensaios a jusante pode ser realizada, incluindo imunohistoquímica, hibridização in situ e triagem celular.
O agente silício é extremamente inflamável e extremamente tóxico. Deve ser sempre manuseado com cuidado e equipamento de proteção individual adequado dentro de um capô de fumaça.
