Bu protokol, tek bir dönüşüm adımında farklı lokuslarda birden fazla ifade kaseti getirerek Saccharomyces cerevisiae'nin Multipleks Genom Düzenlemesi için yeni bir yöntem göstermektedir. Tek bir crRNA dizisini ifade etmek için bu klonlama ücretsiz plazmid montaj yaklaşımı, hızlı, verimli ve esnek genom düzenleme protokolüne yol açar. Serbest genomik loci üzerinde ücretsiz heterolog genler getirerek karotenoidler üretmek için yabani tip maya hücreleri tasarlayacağız.
Tek crRNA dizisi, RNA polimeraz serbest organizatöründen ifade edilen ücretsiz tek tek crRNA'lardan oluşur. Cas12a, crRNA dizisini tek tek crRNA'lara dönüştürür. CRRNA'lar Cas12a'yı genomik DNA'daki hedef lokusa yönlendirir ve cas12a çift iplikçik kırıkları sunar.
Aşağı doğru DNA parçaları in vivo rekombinasyon için yeniden birleşir ve genomik DNA'ya entegre. Protokolü gösteren bir doktora öğrencisi olan Klaudia Ciurkot olacak. Jeffery van Wijk, yardımcı bilim adamı.
Ve Brenda Vonk, laboratuvarımızdan kıdemli doçent. Sentetik DNA'nın Multiplex Genom Düzenleme deneyleri için tek bir crRNA dizisi aldıktan sonra, PCR amplifikasyon karışımını hazırlayın ve diziyi amplifikasyon için termocycler'a yükleyin. PCR ürünlerini elektroforez ile analiz etmek için numuneleri 5 V/cm'de %0,8 agarose jel üzerinde 40 dakika çalıştırın.
DNA merdivenini 100 10000 baz çiftlerinden oluşan DNA parçalarıyla yükleyin Sonra PCR ürünlerini üreticinin talimatlarına göre pcr arıtma kiti kullanarak arındırın. Maya dönüşümü için, 20 mL'lik maya ekstresi peptone dekstroz veya YEPD ortasını içeren 100 mL'lik bir şişede yabani tip mayanın önceden kızartılmasıyla başlar. Bir gecede kuluçka için, 30 santigrat derece, ve dakikada 250 rotasyonertesi sabah, bir gecede kültür öncesi maya hesaplanan hacmi ile taze YEPD orta 20 mL aşılamak.
600 nanometre ile ölçülen 1.0 optik yoğunluk ulaşana kadar kültürü sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin. Maya hücrelerini santrifüj le hasat edin. Maya hücreli peleti oda sıcaklığında 20 mL'lik demineralize suyla yıkayın ve ardından ek bir santrifüj edin.
Lityum asetat Tris-EDTA çözeltisi 100 mikrolitre pelet resuspend ve bir mikrosantrifüj tüpü maya aktarın. Maya hücresi süspansiyonu ile beş mikrolitre tek iplikçikli taşıyıcı DNA ve bir mikrogram plazmid pCSN067'yi karıştırın. Daha sonra 600 mikrolitre polietilen glikol LiAc-TE çözeltisini numuneile karıştırın.
Bir masa üstü ısı bloğunda 30 derece santigrat ve 450 prm maya hücreleri ve plazmid inkübün. Kuluçka sonunda 70 mL'lik dimetil sülfoksit ile dönüşüm çözeltisini karıştırın. Isı 42 derece santigrat su banyosunda 15 dakika boyunca karışımı şok.
Karışımı 15 mL yuvarlak alt boruya aktarın. 30 santigrat derece ve 250 rpm bir gecede kuluçka için tüp e 10 mL YEPD ekleyin. Ertesi sabah, dönüştürülmüş hücreleri santrifüj le toplayın ve supernatantın son 200 mikrolitresi hariç hepsini aspire edin.
Kalan supernatant dönüştürülmüş maya hücre pelet resuspend. Plaka 150 mikrolitre dönüşüm karışımı, ve 150 mikrolitre 20 kez seyreltme yepd dönüşüm karışımı kalan 50 mikrolitre, YEPD agar plakaları üzerinde, G418 litre başına 0.2 gram ile desteklenmektedir. 30 santigrat derecede 48 ila 72 saat sonra, G418'in 0,2 g/L'si ile desteklenen yeni bir YEPD agar plakası üzerinde yeniden streaking için tek bir dönüştürücü seçin.
İkinci dönüşüm için, sadece gösterildiği gibi, 1.0 600 nanometre bir optik yoğunluğu kültürü büyümek. Ve bir mikrosantrifüj tüpüne 20 mikrolitre hücre ekleyin. Santrifüjden sonra hücre peletini 100 mikrolitre LiAc-TE çözeltisinde yeniden askıya alın ve ssDNA ekleyin.
Ayrı bir tüpte, tek crRNA dizisinin bir mikrogramını, crRNA dizisi için doğrusallaştırılmış alıcı plazmidinin bir mikrogramını, her donör DNA'sının bir mikrogramını ve her bir yan bölgenin bir mikrogramını birleştirin. Daha sonra DNA karışımını yetkili maya hücrelerinin tüpüne aktarın ve ilk dönüşümde gösterildiği gibi ikinci dönüşümü tamamlayın. Ertesi sabah, santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant küçük bir aliquot pelet resuspend.
Sonra 150 mikrolitre dönüşüm karışımını plakalayın, ve YEPD ortamda dönüşüm karışımı 20 kez seyreltme 150 mikrolitre, YEPD agar plakaları üzerine 0.2 g/L G418 ile takviye, ve 0.2 g/L nourseothricin Sonra 48 ila 72 saat, 30 santigrat derece, tek renkli koloniler elde etmek için yeni bir YEPD plaka üzerinde yeniden streaking için tek renkli transformant seçin. Genom düzenleme verimliliğini belirlemek için, dönüşüm plakaları üzerindeki renkli ve beyaz kolonilerin sayısını sayın ve renkli kolonilerin sayısını toplam koloni sayısına bölün. Maya piksel sanat oluşturmak için, s.cerevisiae suşları üreten üç farklı renkli karotenoid ile YEPD orta 100 mL içeren bireysel 500 mL sallamak şişeleri aşılamak ve vahşi bir türü CEN.
PK113-7D suşu. 250 rpm de sallayarak 30 santigrat derece bir gecede kültürleri kuluçka. Her gece kültürünün 0,5 mL'sini tüp başına 0,5 mL steril, iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortam içeren tek tek tüplere aktarın ve çözeltileri girdap layarak kısaca karıştırın.
Hücre süspansiyonlarını bireysel, nitelikli rezervuar 2'ye 3 kuyuya aktarın. Uygun nitelikli rezervuar kaynak plakasından 50 mL YEPD agar içeren 6144 kuyu luk hedef mikroplakaya her S.cerevisiae suşunun 25 nanolitresini tespit etmek için akustik sıvı işleyici aletinde 6RES_AQ_GPSA2 sıvı kalibrasyon ayarı olan bir csv dosyası kullanın. Tüm kuyular tespit edildiğinde, mikro plakayı 30 degress Santigrat'ta 48 saat kuluçkaya yatırın.
Suşların renklerini yoğunlaştırmak için, agar plakalarını en az 72 saat boyunca 4 derecede saklayın. Rosalind Franklin'in bir resmi tabakta belirdi. Gösterildiği gibi, organizatör, açık okuma çerçevesi, terminatör ve iki bitişik 50 bp konektör dizileri bir Golden Gate klonlama reaksiyonu ile bir ifade kaset içine monte edilebilir ve PCR tarafından doğrulandı.
TEK crRNA dizisinin PCR tarafından amplifikasyonundan sonra, tek crRNA dizisinin alıcı plazmidi elektroforez tarafından doğrusallaştırılı. Multipleks Genom Düzenleme verimliliği dönüşümden sonra renkli kolonilerin yüzdesi ile hesaplanabilir, ve PCR analizleri sonuçları ile amaçlanan genomik DNA konumlarında donör DNA entegrasyonu onaylamak. Örneğin, Rosalind Franklin'in siyah beyaz resminden başlayarak, dört renkli bir resim ve tespit listesi oluşturuldu ve daha sonra bir agar mikroplaka üzerindeki dört farklı maya suşlarını akustik sıvı işleyicisi aracılığıyla tespit etmek için kullanıldı, gösterildiği gibi, bilim adamının yüksek çözünürlüklü maya boyamaile sonuçlandı.
Bu dönüşüm için, yeni hazırlanmış çözeltiler ve yüksek kalitede DNA parçaları kullanın. Bu yöntem, tanımlanmış silmelerin ve nokta mutasyonlarının genomik DNA'ya çok katlı olarak tanıtılması için de uygulanabilir. Buna ek olarak, CRISPR düzenleme deneyleri yapılabilir.
Bu yöntem, yapılabilir eşzamanlı değişikliklerin sayısını artırmak için bir dizi içinde ücretsiz crRNA'lardan daha fazlasını tanıtmak için değiştirilebilir.
