Questo protocollo dimostra un nuovo metodo per l'editing del genoma multiplex di Saccharomyces cerevisiae introducendo più cassette di espressione su loci diversi in un unico passaggio di trasformazione. Questo approccio di assemblaggio plasmide libero dalla clonazione per esprimere un singolo array di crRNA, porta a un protocollo di editing del genoma rapido, efficiente e flessibile. Ingegnericheremo cellule di lievito di tipo selvatico, per produrre carotenoidi introducendo geni eterologi liberi su loci genomici liberi.
Il singolo array crRNA è composto da crRNA individuali liberi espressi dal promotore libero dell'RNA polimerasi. Cas12a elabora in vivo l'array crRNA in singoli crRNA. I crRNA guidano Cas12a verso il loci bersaglio sul DNA genomico dove Cas12a introduce rotture a doppio filamento.
Frammenti di DNA verso il basso si ricombinano per la ricombinazione in vivo e si integrano nel DNA genomico. A dimostrare il protocollo sarà Klaudia Ciurkot, dottoranda. Jeffery van Wijk, scienziato associato.
E Brenda Vonk, una scienziata associata senior del nostro laboratorio. Dopo aver ottenuto un singolo array di crRNA per esperimenti multiplex genome editing di DNA sintetico, preparare il mix di amplificazione PCR e caricare l'array nel termociclo per l'amplificazione. Per analizzare i prodotti PCR per elettroforesi, eseguire i campioni su un gel di agarosio dello 0,8% a 5 V/cm per 40 minuti.
Caricare la scala del DNA con i frammenti di DNA che vanno da 100 10000 coppie di basi Quindi purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Per la trasformazione del lievito, iniziare pre-coltivando lievito di tipo selvatico in un pallone da 100 ml contenente 20 ml di estratto di lievito peptone destrosio o mezzo YEPD. Per un'incubazione notturna, a 30 gradi Celsius e 250 rotazioni al minuto La mattina successiva, inoculare 20 mL di mezzo YEPD fresco con un volume calcolato di lievito pre-coltura notturno.
Posizionare la coltura in un incubatore di scuotimento fino a raggiungere una densità ottica di 1,0, misurata a 600 nanometri. Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione. Lavare il pellet di cellule di lievito in 20 mL di acqua demineralizzata a temperatura ambiente, seguita da un'ulteriore centrifugazione.
Rimescolare il pellet in 100 microlitri di soluzione tris-EDTA di acetato di litio e trasferire il lievito in un tubo di microcentrifugo. Mescolare cinque microlitri di DNA portante a singolo filamento e un microgrammo di pCSN067 plasmide con la sospensione cellulare del lievito. Quindi mescolare 600 microlitri di soluzione di polietilene glicole LiAc-TE con il campione.
Incubare le cellule di lievito e il plasmide per 30 minuti a 30 gradi Celsius e 450 prm in un blocco di calore superiore del tavolo. Al termine dell'incubazione, mescolare 70 mL di solfossido di dimetile con la soluzione di trasformazione. Scaldare la miscela per 15 minuti in un bagno d'acqua di 42 gradi Celsius.
Trasferire la miscela su un tubo inferiore rotondo da 15 ml. Aggiungere 10 ml di YEPD al tubo per un'incubazione notturna a 30 gradi Celsius e 250 giri/min. La mattina seguente, raccogli le cellule trasformate per centrifugazione e aspira tutti tranne gli ultimi 200 microlitri del supernatante.
Rimescolare il pellet cellulare di lievito trasformato nel supernatante rimanente. Piastra 150 microlitri del mix di trasformazione e 150 microlitri di una diluizione 20 volte superiore dei restanti 50 microlitri di mix di trasformazione in YEPD, su piastre di agar YEPD, integrati con 0,2 grammi per litro di G418. Dopo 48-72 ore a 30 gradi Celsius, scegli un singolo trasformatore per ristriature su una nuova piastra di agar YEPD integrata con 0,2 g / L di G418.
Per la seconda trasformazione, far crescere la cultura a una densità ottica a 600 nanometri di 1,0, come appena dimostrato. E aggiungere 20 microlitri di cellule a un tubo di microcentrifugo. Dopo la centrifugazione, rimescolare il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione LiAc-TE e aggiungere ssDNA.
In un tubo separato, combinare un microgrammo del singolo array di crRNA, un microgrammo del plasmide ricevente linearizzato per l'array di crRNA, un microgrammo di ogni DNA donatore e un microgrammo di ogni regione di fianco. Quindi trasferire la miscela di DNA nel tubo di cellule di lievito competenti e completare la seconda trasformazione come dimostrato per la prima trasformazione. La mattina seguente, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare il pellet in una piccola aliquota di supernatante.
Quindi placcare 150 microlitri del mix di trasformazione, e 150 microlitri di una diluizione 20 volte superiore del mix di trasformazione in mezzo YEPD, su piastre di agar YEPD integrate con 0,2 g/L G418 e 0,2 g/L nourseothricin Dopo 48-72 ore, a 30 gradi Celsius, scelgono un singolo trasformatore colorato per ristriature su una nuova piastra YEPD per ottenere singole colonie colorate. Per determinare l'efficienza di modifica del genoma, contare il numero di colonie colorate e bianche sulle placche di trasformazione e dividere il numero di colonie colorate per il numero totale di colonie. Per creare pixel art di lievito, inoculare singoli flaconi di frullato da 500 mL contenenti 100 mL di mezzo YEPD con tre carotenoidi di colore diverso che producono ceppi di S.cerevisiae e un CEN di tipo selvaggio.
Ceppo PK113-7D. Incubare le colture durante la notte a 30 gradi Celsius con tremori a 250 giri/min. Trasferire 0,5 mL di ogni coltura notturna su singoli tubi contenenti 0,5 ml di mezzo di gradiente di densità sterile non ionico per tubo e mescolare brevemente le soluzioni mediante vortice.
Trasferire le sospensioni cellulari in singoli serbatoi qualificati 2 per 3 pozzi. Utilizzare un file CSV con l'impostazione di calibrazione del fluido 6RES_AQ_GPSA2 su uno strumento di gestione del liquido acustico per individuare 25 nanolitri di ogni ceppo S.cerevisiae dalla piastra di sorgente del serbatoio qualificata appropriata su una micropiastra di destinazione del pozzo 6144 contenente 50 mL di agar YEPD. Quando tutti i pozzi sono stati avvistati, incubare la micropiatta a 30 gradi Celsius per 48 ore.
Per intensificare i colori dei ceppi, conservare le piastre di agar a 4 gradi Celsius per almeno 72 ore. Una foto di Rosalind Franklin è apparsa sul piatto. Come dimostrato, promotore, frame di lettura aperto, terminatore e due sequenze contigue di connettori da 50 bp possono essere assemblate in una cassetta di espressione tramite una reazione di clonazione golden gate e verificate da PCR.
Dopo l'amplificazione del singolo array di crRNA da parte della PCR, il plasmide ricevente per il singolo array di crRNA viene linearizzato come confermato dall'elettroforesi. L'efficienza del Multiplex Genome Editing può essere calcolata dalla percentuale di colonie colorate dopo la trasformazione e dai risultati delle analisi PCR che confermano l'integrazione del DNA del donatore nelle posizioni del DNA genomico previsto. Ad esempio, partendo da un'immagine in bianco e nero di Rosalind Franklin, è stata creata un'immagine a quattro colori e una lista di avvistamenti che è stata poi utilizzata per individuare i quattro diversi ceppi di lievito su una micropiatta di agar tramite un gestore liquido acustico, come dimostrato, con conseguente pittura di lievito ad alta risoluzione dello scienziato.
Per questa trasformazione, utilizzare soluzioni preparate al momento e frammenti di DNA di alta qualità. Questo metodo può anche essere applicato per l'introduzione multiplex di deduzioni definite e mutazioni puntili nel DNA genomico. Inoltre, è possibile eseguire esperimenti di regolazione CRISPR.
Questo metodo può essere modificato per introdurre più di crRNA liberi all'interno di una matrice per aumentare il numero di modifiche simultanee che possono essere apportate.
