이 프로토콜은 단일 변환 단계에서 다른 loci에 여러 발현 카세트를 도입하여 사카로미세스 cerevisiae의 멀티플렉스 게놈 편집을 위한 새로운 방법을 보여줍니다. 단일 crRNA 어레이를 표현하기 위한 이 복제 무료 플라스미드 어셈블리 접근 방식은 신속하고 효율적이며 유연한 게놈 편집 프로토콜로 이어집니다. 우리는 야생 형 효모 세포를 설계하여 무료 게놈 loci에 무료 이종 유전자를 도입하여 카로티노이드를 생산할 것입니다.
단일 crRNA 어레이는 RNA 폴리머라제 프리 프로모터로부터 발현된 자유로운 개별 crRNA로 구성된다. Cas12a는 crRNA 배열을 개별 crRNA로 생체 내에서 처리합니다. crRNAs는 Cas12a가 이중 가닥 브레이크를 소개하는 게놈 DNA에 있는 표적 loci에 Cas12a를 안내합니다.
하향 DNA 단편은 생체 내 재조합을 위해 재결합하고 게놈 DNA에 통합합니다. 프로토콜을 시연하는 것은 박사 과정 학생인 클라우디아 시우르코트(Klaudia Ciurkot)입니다. 제프리 반 위크, 준과학자.
그리고 브렌다 본크, 우리의 실험실에서 수석 준 과학자. 합성 DNA의 멀티플렉스 게놈 편집 실험을 위한 단일 crRNA 어레이를 얻은 후 PCR 증폭 믹스를 준비하고, 증폭을 위해 열순환기로 배열을 로드한다. 전기전도로 PCR 제품을 분석하려면 샘플을 5V/cm에서 0.8%의 아가로즈 젤로 40분간 실행합니다.
DNA 사다리에 100 10000 베이스 쌍에 이르는 DNA 조각을 적재한 다음 제조업체의 지시에 따라 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 효모 변환을 위해, 효모 추출물 펩톤 덱스트로스 또는 YEPD 배지의 20mL를 포함하는 100mL 플라스크에서 야생형 효모를 미리 배양하는 것으로 시작한다. 하룻밤 배양의 경우, 섭씨 30도, 분당 250회 회전 다음날 아침, 하룻밤 전 배양 효모의 계산된 부피로 신선한 YEPD 배지 20mL를 접종한다.
600 나노미터로 측정된 1.0의 광학 밀도가 도달할 때까지 흔들리는 인큐베이터에 배양을 놓습니다. 원심분리에 의해 효모 세포를 수확한다. 효모 세포 펠릿을 실온 탈염 수의 20mL로 씻고 추가 원심 분리가 뒤따릅니다.
리튬 아세테이트 Tris-EDTA 용액의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 효모를 미세 원심 분리튜브로 옮기습니다. 단일 좌초 캐리어 DNA의 5 마이크로 리터와 플라스미드 pCSN067의 마이크로 그램을 효모 세포 현탁액과 혼합합니다. 그런 다음 폴리에틸렌 글리콜 LiAc-TE 용액 600 마이크로리터를 샘플과 혼합합니다.
효모 세포와 플라스미드를 섭씨 30도에서 30분, 테이블 탑 히트 블록에 450prm을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 디메틸 설프리산화물 70mL를 변환 용액과 혼합합니다. 42도의 수조에서 혼합물을 15분 동안 열충격을 가합니다.
혼합물을 15mL 원형 하단 튜브로 옮기. 10mL의 YEPD를 튜브에 추가하여 섭씨 30도, rpm 250도에서 하룻밤 동안 배양을 합니다. 다음 날 아침, 원심분리에 의해 변형된 세포를 수집하고, 상류체의 최종 200 마이크로리터를 제외한 모든 것을 흡인한다.
나머지 상체에서 변형 된 효모 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 변형 믹스의 플레이트 150 마이크로리터, 및 YEPD에서 변형 믹스의 나머지 50 마이크로 리터의 20 배 희석의 150 마이크로 리터, YEPD 천접시에, G418의 리터 당 0.2 그램으로 보충. 섭씨 30도에서 48~72시간 후, G418의 0.2g/L로 보충된 새로운 YEPD 한천 판을 다시 선적하기 위해 단일 변압제를 선택하십시오.
두 번째 변환을 위해, 방금 입증된 것처럼 배양을 600 나노미터1.0미터에서 광학 밀도로 성장시다. 또한 마이크로센심분리기 튜브에 20마이크로리터의 세포를 추가합니다. 원심 분리 후 LiAc-TE 용액의 100 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 ssDNA를 추가합니다.
별도의 튜브에서, 단일 crRNA 어레이의 1마이크로그램, crRNA 어레이를 위한 선형화된 수신자 플라스미드의 1마이크로그램, 각 기증자 DNA의 1마이크로그램 및 각 측면 영역의 1마이크로그램을 결합한다. 그런 다음 DNA 혼합물을 유능한 효모 세포의 튜브로 옮기고 제1 변환을 위해 입증된 바와 같이 두 번째 변환을 완료합니다. 다음 날 아침, 원심분리로 세포를 수집하고 상류제의 작은 알리쿼트에 펠릿을 다시 놓습니다.
그런 다음 변환 믹스의 150 마이크로 리터를 플레이트, YEPD 배지에서 변형 믹스의 20배 희석제 150마이크로리터, YEPD 에이프라 플레이트에 0.2g/L G418로 보충되고, 48~72시간 후 0.2g/L nourseothricin을 30도에서, 새로운 YEPD 플레이트에서 단일 컬러 변환제를 선택하여 새로운 YEPD 플레이트를 획득할 수 있습니다. 게놈 편집 효율을 결정하기 위해 변환 플레이트의 유색 및 흰색 식민지 수를 계산하고 유색 식민지 수를 총 식민지 수로 나눕니다. 효모 픽셀 아트를 만들기 위해 YEPD 배지 100mL를 포함하는 개별 500mL 쉐이크 플라스크를 접종하고 S.cerevisiae 균주를 생산하는 세 가지 다른 색의 카로티노이드와 야생 형 CEN을 생성합니다.
PK113-7D 스트레인. 250 rpm에서 흔들어와 섭씨 30도에서 하룻밤 문화를 배양. 각 야간 배양의 0.5mL을 튜브당 0.5mL, 비이온 밀도 그라데이션 배지를 포함하는 개별 튜브로 전송하고, 소용돌이에 의해 용액을 짧게 혼합한다.
셀 서스펜션을 개별, 자격을 갖춘 저수지 2 x 3 개의 우물로 전송합니다. 음향 액체 처리기 기기에 6RES_AQ_GPSA2 유체 교정 설정이 있는 csv 파일을 사용하여 YEPD agar 50mL를 포함하는 6144개의 웰 대상 마이크로플레이트에 적절한 자격을 갖춘 저수지 소스 플레이트에서 각 S.cerevisiae 변형의 25 나노리터를 발견한다. 모든 우물이 발견되면 마이크로 플레이트를 48 시간 동안 섭씨 30에서 배양하십시오.
균주의 색상을 강화하려면 한천 판을 섭씨 4도에서 최소 72시간 동안 보관하십시오. 로잘린드 프랭클린의 사진이 접시에 나타났다. 입증된 바와 같이, 프로모터, 오픈 판독 프레임, 터미네이터 및 두 개의 연속적인 50bp 커넥터 시퀀스를 골든 게이트 복제 반응을 통해 발현 카세트로 조립하고 PCR에 의해 검증될 수 있다.
PCR에 의한 단일 crRNA 어레이의 증폭 후, 단일 crRNA 어레이에 대한 수신자 플라스미드는 전기포고증에 의해 확인된 바와 같이 선형화된다. 멀티플렉스 게놈 편집의 효율은 변형 후 유색 식민지의 백분율에 의해 계산될 수 있으며, 의도된 게놈 DNA 위치에서 기증자 DNA의 통합을 확인하는 PCR 분석결과에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, 로잘린드 프랭클린의 흑백 사진에서 시작하여, 4가지 색상 사진과 스포팅 리스트가 만들어졌으며, 이는 음향 액체 처리기를 통해 한천 마이크로 플레이트에서 4개의 다른 효모 균주를 발견하는 데 사용되어 과학자의 고해상도 효모 페인팅을 초래했습니다.
이러한 변환을 위해 갓 준비된 솔루션과 고품질의 DNA 단편을 사용하십시오. 이 방법은 또한 게놈 DNA로 정의된 삭제 및 점 돌연변이의 멀티플렉스 도입을 위해 적용될 수 있습니다. 또한 CRISPR 규정 실험을 수행할 수 있습니다.
이 메서드는 배열 내에서 자유 crRNA 이상을 도입하여 동시 수정 횟수를 늘리기 위해 수정할 수 있습니다.
