Этот протокол демонстрирует новый метод редактирования мультиплексного генома Saccharomyces cerevisiae путем введения нескольких экспрессионных кассет на разных локусах в один шаг преобразования. Такой подход к свободной плазмидной сборке для выражения единого массива crRNA приводит к быстрому, эффективному и гибкому протоколу редактирования генома. Мы будем инженер диких клеток дрожжей типа, для производства каротиноидов путем введения свободных гетерологических генов на свободных геномных локусов.
Единый массив crRNA состоит из свободных индивидуальных crRNAs, выраженных из РНК полимеразы бесплатно промоутер. Cas12a обрабатывает в vivo массив crRNA в отдельные CRRNA. CRRNAs направляет Cas12a к локусу цели на геномной ДНК, где Cas12a вводит двойные разрывы нитей.
Снижение фрагментов ДНК рекомбинации для рекомбинации in vivo и интеграции в геномную ДНК. Демонстрацией протокола будет Клаудия Тюркот, аспирантка. Джеффри ван Вейк, научный сотрудник.
И Бренда Вонк, старший научный сотрудник нашей лаборатории. После получения единого массива crRNA для экспериментов по редактированию генома мультиплекса синтетической ДНК, подготовьте смесь усиления ПЦР и загрузите массив в термоциклер для усиления. Для анализа продуктов ПЦР с помощью электрофорез, запустить образцы на 0,8%агарозный гель при 5 В/см в течение 40 минут.
Загрузите лестницу ДНК с фрагментами ДНК, начиная от 100 10000 базовых пар Затем очистите продукты ПЦР с помощью комплекта очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Для преобразования дрожжей, начните с предварительного культивирования диких дрожжей типа в 100 мл колбы, содержащей 20 мл дрожжевого экстракта пептон dextrose или YEPD среды. Для ночной инкубации, при 30 градусах по Цельсию, и 250 вращений в минуту На следующее утро, привить 20 мл свежей среды YEPD с рассчитанным объемом ночных до культуры дрожжей.
Поместите культуру в трясущимся инкубатором до тех пор, пока не будет достигнута оптическая плотность 1,0, измеряемая на 600 нанометров. Урожай дрожжевых клеток путем центрифугации. Вымойте гранулы дрожжевой клетки в 20 мл комнатной температуры деминерализованной воды, а затем дополнительную центрифугу.
Повторно посовестите гранулы в 100 микролитров раствора литиевого ацетата Tris-EDTA и перенесите дрожжи в микроцентрифугную трубку. Смешайте пять микролитров одноклеточной ДНК носителя и один микрограмм плазмидного pCSN067 с подвеской дрожжевых клеток. Затем смешайте с образцом 600 микролитров полиэтиленгликоль LiAc-TE.
Инкубировать дрожжевые клетки и плазмид в течение 30 минут при температуре 30 градусов по Цельсию и 450 prm в тепловой блок столешного верха. В конце инкубации смешайте 70 мл диметилсуфсида с раствором преобразования. Тепло удар смеси в течение 15 минут в 42 градусов по Цельсию водяной бане.
Перенесите смесь в круглую нижнюю трубку 15 мл. Добавьте 10 мл YEPD в трубку для ночной инкубации при 30 градусах по Цельсию и 250 об/мин. На следующее утро, собирать преобразованные клетки центрифугации, и аспирировать все, кроме окончательного 200 микролитров супернатанта.
Resuspend преобразованных дрожжевых клеток гранулы в оставшихся supernatant. Плита 150 микролитров трансформационного смеси и 150 микролитров 20-времени разбавления оставшихся 50 микролитров трансформационной смеси в YEPD, на агарных пластинах YEPD, дополненных 0,2 грамма на литр G418. После 48 до 72 часов при 30 градусах по Цельсию, выберите один трансформант для повторной полосы на новой пластине YEPD агар дополнен 0,2 г/л G418.
Для второй трансформации, расти культуры оптической плотности на 600 нанометров 1,0, как только что продемонстрировали. И добавьте 20 микролитров клеток в микроцентрифугную трубку. После центрифугации, повторно поместить клеточные гранулы в 100 микролитров раствора LiAc-TE, и добавить ssDNA.
В отдельной трубке объединить один микрограмм одного массива crRNA, один микрограмм линейной плазмиды реципиента для массива crRNA, по одному микрограмму ДНК каждого донора и по одному микрограмму каждой фланговой области. Затем перенесите смесь ДНК в трубку компетентных дрожжевых клеток и завершите вторую трансформацию, как это было продемонстрировано при первой трансформации. На следующее утро, собирать клетки центрифугации и повторно гранулы в небольшой aliquot супернатанта.
Затем пластина 150 микролитров преобразования смеси, и 150 микролитров 20 разбавления преобразования смеси в yepD среды, на YEPD агар пластины дополнены 0,2 г / л G418, и 0,2 г / л nourseothricin После 48 до 72 часов, при 30 градусах по Цельсию, выбрать один цветной трансформант для повторной полосы на новой пластине YEPD для получения одного цвета колоний. Чтобы определить эффективность редактирования генома, подсчитайте количество цветных и белых колоний на пластинах преобразования и разделите количество цветных колоний на общее количество колоний. Для создания дрожжей пиксель искусства, привить отдельные 500 мл встряхнуть колбы, содержащие 100 мл среды YEPD с тремя разноцветными каротиноида производства штаммов S.cerevisiae, и дикий тип CEN.
Штамм PK113-7D. Инкубировать культур ночь на 30 градусов по Цельсию с тряской на 250 об / мин. Передача 0,5 мл каждой ночной культуры в отдельные трубки, содержащие 0,5 мл стерильной, неионной плотности градиента среды на трубку, и кратко смешивать решения вихрем.
Передача клеточных суспензий в отдельные, квалифицированные резервуары 2 на 3 скважины. Используйте csv файл с настройками калибровки жидкости 6RES_AQ_GPSA2 на акустическом инструменте обработчика жидкости, чтобы обнаружить 25 нанолитров каждого штамма S.cerevisiae от соответствующей квалифицированной пластины источника резервуара на микроплюйте 6144, содержащей 50 мл агара YEPD. Когда все скважины были замечены, инкубировать микроплюрат при 30 дегресс по Цельсию в течение 48 часов.
Чтобы усилить цвета штаммов, хранить агар пластин при 4 градусах по Цельсию, по крайней мере 72 часов. На тарелке появилась фотография Розалинд Франклин. Как попродемонстрировано, промоутер, открытый читальный каркас, терминатор и две смежные последовательности разъемов 50 bp могут быть собраны в кассету выражения с помощью реакции клонирования Золотых Ворот и проверены ПЦР.
После усиления единого массива CRRNA ПЦР плазмида получателя для одного массива crRNA линейно подтверждается электрофорезом. Эффективность редактирования мультиплексного генома может быть рассчитана по проценту цветных колоний после преобразования, а также по результатам ПЦР-анализов, которые подтверждают интеграцию донорской ДНК в предполагаемых геномных местах ДНК. Например, начиная с черно-белой картины Розалинд Франклин, четыре цветные изображения и пятнистость список был создан, который затем был использован для выявления четырех различных штаммов дрожжей на агар микроплюе через акустический обработчик жидкости, как попродемонстрировано, в результате чего с высоким разрешением дрожжевой живописи ученого.
Для этой трансформации используйте свежеприготовленные растворы и фрагменты ДНК высокого качества. Этот метод также может быть применен для мультиплексного введения определенных удалений и точечных мутаций в геномную ДНК. Кроме того, могут быть проведены эксперименты по регулированию CRISPR.
Этот метод может быть изменен, чтобы ввести больше, чем бесплатные CRRNAs в массиве, чтобы увеличить количество одновременных изменений, которые могут быть сделаны.
