HPV RNA CISH aktif bir human papilloma virüs enfeksiyonu nun saptanmasına izin verir. Yerinde hibridizasyon HPV RNA'yı hedef aldığından bu teknik virüsün aktif transkripsiyonunun görüntülenmesine olanak sağlar. Bu kesin mekansal çözünürlük ve iyi tanı performansları vardır.
HPV'nin saptanması orofarengeal skuamöz hücreli karsinom veya servikal neoplazi gibi HPV'ye bağlı çeşitli lezyonların tanısını destekleyebilir. Ayrıca prognoz üzerinde bir etkisi olabilir. Tamponlar ve karşı boyama reaktifleri hazırladıktan sonra, 630 mililitre distile suya 70 mililitre 10x hedef alma reaktifi ekleyerek büyük bir kabın içinde bir x hedef alma reaktifi hazırlayın.
Manyetik karıştırıcı ile bir ısıtma plakası üzerine beher yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplayın. 100 santigrat derecede 10-15 dakika kaynatın ve 30 dakikadan uzun kaynatın. Daha önce deparafinize edilmiş ve slayt rafına yerleştirilen doku bölümleri ile slaytlarda peroksidaz aktivitesini engellemek için, her slayta hidrojen peroksit örneği kapsayacak kadar dört ila altı damla ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Slaytları iki dakika boyunca iki kez oda sıcaklığında distile suda yıkayın. RNA doku bölümlerinde RNA doku sınırları kırmak için, ilk bir pençe kullanarak kaynayan bir x TRR alüminyum folyo çıkarın ve karıştırma durdurmak. Slayt rafını yavaşça ve çok dikkatli bir şekilde batırın.
Kabı tekrar alüminyum folyo ile kapatın ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hemen distile su banyosu için sıcak slayt raf aktarmak ve iki dakika boyunca yıkamapençe kullanın. Slaytları daha sonra taze %100 etanolde iki dakika boyunca yıkayın ve oda sıcaklığında iki dakika kurumasını bekleyin.
Daha sonra, her numunenin etrafına bir bariyer çizmek için hidrofobik bariyer kalemkullanın ve en az beş dakika kurumasını bekleyin. Proteaz sindirim için, nem kontrollü tepsiye slaytlar yerleştirin ve örnek başına Proteaz Plus yaklaşık dört damla ekleyin. Tepsiyi bir kapakla kapatın ve 40 derecede 30 dakika hibritleştirme fırınına takın.
Tepsiyi fırından çıkarın ve slayt rafını çıkarın. Her seferinde bir slayt çalışma, hızlı bir şekilde herhangi bir fazla sıvı kaldırmak ve distile su ile dolu bir boyama çanağı batırılmış slayt rafına slayt yerleştirin. Sürekli ajitasyon ile oda sıcaklığında distile suda iki dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın.
Hibritleştirmeye başlamak için, fazla sıvıyı çıkarmak ve slayt rafına geri yerleştirmek için slaytlara dokunun ve hafifçe vurun. Önceden ısıtılmış HPV probu fırından çıkarın ve her bölümü tamamen kapsayacak şekilde yaklaşık dört damla ekleyin. Tepsinin üzerini kapakla kapatın ve 40 derecede iki saat fırına takın.
Kuluçkayı tamamladıktan sonra tepsiyi fırından çıkarın ve slayt rafını çıkarın. Her seferinde bir slayt, hızlı bir şekilde herhangi bir fazla sıvı kaldırmak ve slayt bir x yıkama tampon ile dolu bir boyama çanak batık slayt rafına yerleştirin, sürekli ajitasyon ile oda sıcaklığında iki dakika boyunca slaytyıkama, ve taze bir x yıkama tampon ile tekrarlayın. Slaytlardan fazla sıvıyı çıkarmak için dokunun ve hafifçe vurun ve slayt rafına tekrar yerleştirin.
Her bölümü tamamen kapsayacak şekilde bölüm başına yaklaşık dört damla oda sıcaklığında AMP1 ekleyin. Tepsinin üzerini kapakla kapatın ve 40 derecede 30 dakika fırına takın. Tepsiyi fırından çıkardıktan sonra kaydırma rafını çıkarın.
Bir seferde bir slayt çalışma, hızlı bir şekilde herhangi bir fazla sıvı kaldırmak ve slayt rafta bir x yıkama tampon ile dolu bir boyama çanağı batık yerleştirin, sürekli ajitasyon ile oda sıcaklığında iki dakika yıkama, ve taze bir x yıkama tampon ile tekrarlayın. Her dab-A ve DAB-B çözeltisinin aynı sayıda damlasını uygun büyüklükteki bir tüpe dağıtarak her bölüm başına yaklaşık 120 mikrolitre DAB substratı ve girdap yapın. Slayt rafından her bir slaytı teker teker alın ve fazla sıvıyı çıkarmak için dokunun ve kaydırağını geri yerleştirin.
Pipet her doku bölümü üzerine DAB karışımı yaklaşık 120 mikrolitre, bölümlerin kaplı olduğundan emin olun. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatvere ve karşı boyama ile devam edin. Cam çıta başına bir damla montaj ortamı yerleştirin ve ardından çıtaları kaydıraklara yerleştirin ve havanın kurumasını bekleyin.
Birkaç saat sonra, makalede açıklandığı gibi optik mikroskop kullanarak değerlendirmeye devam edin. Burada açıklandığı gibi baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom, sitoplazmada veya tümör hücrelerinin çekirdeklerinde kahverengi punktikform boyama varlığı pozitif bir olgu yu tanımladı. Sonuçlar iki skora ayrıldı: RNA CISH yüksek ve düşük puan 20x hedefi ile gözlendi.
Tümör hücrelerinin %50'sinin altında gözlendiğinde rna CISH skoru boyama düşük kabul edilir ve hücre yüzeyinin %80'inden azını kaplar. Diğer taraftan, Lekeli kanser hücrelerinin %50'sinden fazlasında veya tümör hücrelerinin %30'undan fazlasında %80'i aşan boyama yüzeyi ile Gözlendiğinde RNA CISH skoru yüksektir. Hibritizasyon için slaytların kurumasına asla izin vermemeliyiz.
Sondayı önceden ısıtmayı unutmayın. Her örnek için, RNA kalitesini değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrol gerçekleştirin.
