Bu yöntemle ele almak istediğimiz temel soru, biyoteknolojik olarak ilgili genlerin klonlanması için yerel gıda pazarlarından satın alınan malzemelerden alınan RNA örneklerini nasıl kullanabileceğimizdir? Burada, pasifik istiridyelerini bu yaklaşımı ve potansiyel daha fazla uygulamayı göstermek için bir vaka çalışması olarak kullanıyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, istiridye örneklerinin geleneksel genom veya cDNA diziliminin atlatılabildiğidir.
Bunun yerine, sitokrom c oksidaz alt birimi I ve NADH dehidrogenaz dizileri en yakından ilgili örneği seçmek için Pasifik istiridye halka açık referans dizileri ile karşılaştırıldı. Bu örnekten hazırlanan cDNA, biyoteknolojik olarak ilgili genlerin klonlanmasında doğrudan kullanılabilir ve bu genler genel dizi bilgileri kullanılarak seçilebilir. Prosedürü gösteren Yongmei Lyu ve Yuquan Li, Glycomics ve Glikan Biyomühendislik Araştırma Merkezi Nanjing Tarım Üniversitesi'nden iki lisansüstü öğrencileri olacaktır.
İstiridye dokusu örneği hazırlamak için, her istiridye numunesinin yaklaşık geometrik merkezinden yaklaşık 100 miligram homojen yumuşak dokuyu kesmek için sterilize edilmiş bir neşter kullanın. Numuneyi 50 mililitre sıvı nitrojenle dolu bir harç içine aktarın. Flaş dondurulmuş istiridye dokusunu ince bir toz haline getirin.
Steril 1.5 mililitrelik santrifüj tüpüiçine her numunenin dondurulmuş doku 75 miligram tartmak ve guanidinium tiyokyanat-fenol ekstraksiyon reaktif bir mililitre ile karıştırın. Bu yordamın en kritik adımı RNA çıkarma adımıdır. RNA bozulmasını en aza indirmek için, istiridye dokusu ve RNA çıkarma hasat arasındaki süreyi azaltmak esastır.
Numuneyi 14, 000 kez g ve 4 santigrat derece 15 dakika santrifüj edin. Yeni bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüp supernatant aktarın, kloroform 200 mikrolitre ekleyin ve karışım süt beyaz dönene kadar 10 ila 15 saniye boyunca bir girdap karıştırıcı üzerinde iyice karıştırın. Sonra, santrifüj daha önce olduğu gibi 15 dakika.
200 mikrolitrelik pipetle, üst sulu tabakayı, interfazı bozmadan, 1,5 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpe dikkatlice aktarın. Santrifüj tüpüne 500 mikrolitre izopropil alkol ekleyin ve numuneleri karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Daha sonra örnekleri 20 dakika buzda bırakın.
Santrifüj 14, 000 kez g ve sekiz dakika boyunca dört derece santigrat, ve supernatant çıkarın. Peleti bir mililitrede %75 etanolle yeniden askıya alın ve 14, 000 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj. Tüm supernatant çıkarın ve etanol yıkama tekrarlayın.
Peletleri oda sıcaklığında altı dakika kurulayın. Daha sonra, kurutulmuş RNA peletini DEPC ile işlenmiş suyun 25 mikrolitresinde eritin ve tüpü buzda tutun. RNA örneklerini 24 saat içinde kullanın.
Bir cDNA kitaplığı oluşturmak için, önce el yazmasına göre çözeltiler ekleyerek 300 mikrolitrelik bir PCR tüpteki her RNA numunesi için bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Tüp içine çıkarılan RNA örneğinin bir mikrolitresini ekleyin. Karışımı bir PCR termocycler'da 60 dakika 42 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve sıcaklığı 5 dakika boyunca 95 dereceye yükseltin.
Oluşturulan cDNA kitaplığını eksi 20 santigrat derecede 12 aya kadar saklayın. İlk olarak, el yazmasına göre hazırlanan PCR karışımları içeren tüplere oluşturulan cDNA kitaplığından bir mikrolitre ekleyin. PCR tüplerini PCR termocycler'a yerleştirin ve pcr amplifikasyonu ilk denatürasyon adımı ve bir uzama adımı, bir uzama adımı ve el yazmasına göre bir denatürasyon adımından oluşan 35 PCR reaksiyon döngüsüyle gerçekleştirin.
Döngülerden sonra, beş dakika boyunca bir sonlandırma adımını gerçekleştirin. Agarose jel elektroforezinin kalitesini doğrulamak için PCR ürününün beş mikrolitresini kullanın. Güçlendirilmiş COX1 veya ND genini sırasıyla 759 veya 748 baz çiftlerinde tek bir bant olarak gözlemleyin.
PCR ürünün geri kalanını arındırmak için, her numuneye yüksek oranda chaotropic tuz içeren 100 mikrolitre DNA bağlayıcı tampon ekleyin. Girdap kısaca içeriğini karıştırmak için. Bir arınma sütunu iki mililitrelik bir santrifüj tüpü içine yerleştirin.
Pipet kolon içine reaksiyon karışımı. Oda sıcaklığında bir dakika için 14,000 kez g bir santrifüj monte sütun ile tüp yerleştirin. İki mililitrelik santrifüj tüpten filtrasyon attıktan sonra, 14,000 kez g santrifüj ederek 700 ve 400 mikrolitre yıkama çözeltisi W2 ile iki kez yıkayın.
Sonra, bir mililitre deiyonize suyu 65 santigrat dereceye ısıtın. Sütunu yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne ve önceden ısıtılmış deiyonize suyun 25 mikrolitrepipeti beyaz kolon zarının ortasına aktarın. Membran oda sıcaklığında bir dakika bekletin.
Daha sonra, oda sıcaklığında bir dakika için 14, 000 kez g sütun ile tüp santrifüj. Sütunu atın ve saflaştırılmış PCR ürünlerini eksi 20 santigrat derecede 12 aya kadar saklayın. İsteğe bağlı olarak, COX1 veya ND ters astarlar da çift yönlü sıralama için kullanılabilir.
Sanger sıralama için, ilgili COX1 veya ND ileri astar kullanın. Sıralama sonuçlarını aldıktan sonra, NCBI Nucleottide BLAST çevrimiçi aracını kullanarak dizileri Pasifik istiridye referans suşunun genom dizisi ile karşılaştırın. MgUGD ve MgUXS genlerinin daha önce yapıldığı gibi PCR ile güçlendirmek ve arındırmak için ilgili ileri ve ters astarları kullanın.
Sindirim tamponu ile saflaştırılmış PCR ürünleri incubating sonra, 1.5 mililitrelik santrifüj tüp içinde pET-30a 500 nanogram eriterek önceden sindirilmiş pET-30a vektör hazırlamak ve 16 mikrolitre kadar kontüzyonlu su ekleyin. Daha sonra, tüp içine 10 kez konsantre sindirim tampon ve 20 birim kısıtlama enonukleases Nde1 ve Xho1 her biri bir mikrolitre iki mikrolitre ekleyin. Karışımı 37 derecede üç saat kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, bir birim alkali fosfataz bir mikrolitre ekleyin ve ek bir saat için 37 derece santigrat de kuluçka. Daha sonra, alkali fosfataz inaktive etmek için 10 dakika boyunca 75 santigrat derece önceden ısıtılmış metal blok ısıtıcı tüp yerleştirin. MgUGD ve MgUXS genleri taşıyan E.coli BL21 hücreleri yetiştirdikten sonra, iki litrelik sallayarak şişe 400 mililitrelik LB orta içine kültür aktarmak, ve 37 santigrat derece sıcaklıkta 200 rpm bir shaker üzerine yerleştirin.
Üç saat sonra, 600 nanometre dalga boyunda bir fotometre üzerinde optik yoğunluğu kontrol edin ve yaklaşık 0,5 bir emilime ulaştığından emin olun. Sonra shaker sıcaklığını 20 santigrat dereceye düşürün. Üç saat boyunca rekombinant proteinlerin ekspresyonunu indüklemek için tek molar IPTG 400 mikrolitre ekleyin.
Hücreleri hasat sonra, dört santigrat derece 20 dakika sonication tarafından hücreleri bozabilir. Santrifüj 14, 000 kez g ve 20 dakika için dört derece santigrat, ve aktivite testi için yeni bir tüp içinde supernatant toplamak. Aktivite tadına varmadıktan sonra, MgUXS ve MgUGD karışımlarına 20 mikrolitre metanol ve 40 mikrolitre kloroform ekleyerek reaksiyonları söndürün.
Girdap örnek karışımları ve santrifüj 14, 000 kez g altı dakika ve dört derece santigrat için. MALDI-TOF kütle spektrometresi için yeni tüpler her tüpün üst sulu tabakasıtoplayın. Bu deneyde, son derece farklı bir numunenin COX1 ve ND gen dizilerinin dizi hizalaması Pasifik istiridye suşu referansı ile karşılaştırıldı.
Kırmızı oklar referans sırası ile elde edilen cDNA örneklerinin sırası arasındaki nükleotit farklılıklarını gösterir. Yakından ilişkili bir istiridye örneğinin COX1 ve ND genlerinin dizileri, Pasifik istiridye suşreferansından düşük sapma göstermektedir. MALDI-TOF kütle spektrometresi, endüstriyel olarak ilgili mgugd ve MgUXS genlerini klonlamak için cDNA kütüphanesinin başarılı bir şekilde uygulanmasını göstermektedir.
Jel görüntü de udp-glukuronik asit ve UDP-ksyoz art arda ifade ve saflaştırılmış MgUGD ve MgUXS enzimatik eylem tarafından oluşturulan tanımlar. Bu yöntem, referans sırası ve elde edilen işaretleyici dizileri arasında mükemmel bir eşleşme gerektirmez ve araştırmacıya referanssız istiridyelerle çalışması için güven vermelidir. Prensip olarak, bu yöntem, yakından ilişkili bir referans türünden dizilerin kamuya açık olduğu referanssız biyolojik numunelere uygulanabilir.
Bu yöntem, uzman olmayan araştırmacıların potansiyel biyolojik öneme sahip genetik materyallere kolayca erişmelerine izin verir ve daha fazla bilim adamının kolayca erişilebilen ancak tam olarak tanımlanmış biyolojik örneklerle çalışmasının önünü açmaktadır.
