La pregunta clave que queremos abordar con este método es ¿cómo podemos utilizar muestras de ARN de material comprado en los mercados alimentarios locales para la clonación de genes biotecnológicamente relevantes? Aquí, utilizamos las ostras del Pacífico como un caso de estudio para demostrar este enfoque y posible aplicación adicional. La principal ventaja de esta técnica es que se puede eludir la secuenciación convencional del genoma o adnc de las muestras de ostras.
En su lugar, se compararon las secuencias de la subunidad I y la deshidrogenasa del citocromo c oxidasa con las secuencias de referencia disponibles públicamente de la ostra del Pacífico para seleccionar el espécimen más estrechamente relacionado. El ADNc preparado a partir de este espécimen se puede utilizar directamente para la clonación de genes biotecnológicamente relevantes, que se pueden seleccionar utilizando la información de la secuencia pública. Demostrando el procedimiento estarán Yongmei Lyu y Yuquan Li, dos estudiantes graduados del Centro de Investigación de Bioingeniería de Glicómica y Glicánía de la Universidad Agrícola de Nanjing.
Para preparar la muestra de tejido de ostras, utilice un bisturí esterilizado para cortar aproximadamente 100 miligramos de tejido blando homogéneo del centro geométrico aproximado de cada muestra de ostra. Transfiera la muestra a un mortero lleno de 50 mililitros de nitrógeno líquido. Moler el tejido de ostras congelados en un polvo fino.
Pesar 75 miligramos del tejido congelado de cada espécimen en un tubo estéril de centrífuga de 1,5 mililitros, y mezclar con un mililitro de reactivo de extracción de guanidinio tiocianato-fenol. El paso más crítico de este procedimiento es el paso de extracción de ARN. Con el fin de minimizar la degradación del ARN, es esencial reducir el tiempo entre la recolección del tejido de ostra y la extracción de ARN.
Centrifugar la muestra a 14.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros, agregue 200 microlitros de cloroformo y mezcle bien en un mezclador de vórtice durante 10 a 15 segundos hasta que la mezcla se vuelva blanca lechosa. A continuación, centrifugar durante 15 minutos como se hizo anteriormente.
Con una pipeta de 200 microlitros, transfiera cuidadosamente la capa acuosa superior, sin alterar la interfase, a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de alcohol isopropílico en el tubo centrífugo e invierta suavemente para mezclar las muestras. Luego deje las muestras sobre hielo durante 20 minutos.
Centrifugar a 14.000 veces g y cuatro grados centígrados durante ocho minutos, y retire el sobrenadante. Resuspender el pellet en un mililitro de 75% etanol, y centrifugar a 14.000 veces g y cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Retire todo el sobrenadante y repita el lavado en etanol.
Seque los pellets durante seis minutos a temperatura ambiente. Luego, disuelva el pellet de ARN seco en 25 microlitros de agua tratada con DEPC, y mantenga el tubo en hielo. Utilice las muestras de ARN en un plazo de 24 horas.
Para generar una biblioteca de ADNc, primero prepare una mezcla de reacción para cada muestra de ARN en un tubo PCR de 300 microlitios añadiendo soluciones según el manuscrito. Agregue un microlitro de la muestra de ARN extraída en el tubo. Incubar la mezcla en un termociclador PCR durante 60 minutos a 42 grados Celsius, y luego aumentar la temperatura a 95 grados Celsius durante cinco minutos.
Almacene la biblioteca de ADNc generada durante un máximo de 12 meses a menos 20 grados centígrados. En primer lugar, añada un microlitro de la biblioteca de ADNc generada a los tubos que contengan mezclas de PCR, preparados de acuerdo con el manuscrito. Coloque los tubos PCR en el termociclador PCR y realice la amplificación de PCR con un paso de desnaturalización inicial y 35 ciclos de reacción PCR que consisten en un paso de recocido, un paso de alargamiento y un paso de desnaturalización según el manuscrito.
Después de los ciclos, realice un paso de alargamiento final durante cinco minutos. Utilice cinco microlitros del producto PCR para verificar la calidad por electroforesis de gel de agarosa. Observe el gen COX1 o ND amplificado como una sola banda en 759 o 748 pares base, respectivamente.
Para purificar el resto del producto PCR, añada 100 microlitros de tampón de unión al ADN que contenga altas concentraciones de sales caotrópicas a cada muestra. Vortex brevemente para mezclar el contenido. Coloque una columna de purificación en un tubo centrífugo de dos mililitros.
Pipetear la mezcla de reacción en la columna. Coloque el tubo con la columna montada en una centrífuga a 14.000 g durante un minuto a temperatura ambiente. Después de desechar el filtrado del tubo centrífugo de dos mililitros, lave dos veces con 700 y 400 microlitros de la solución de lavado W2 centrifugando a 14.000 g.
A continuación, calienta un mililitro de agua desionizada a 65 grados Celsius en un calentador de bloques metálicos. Transfiera la columna a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros y pipetee 25 microlitros del agua desionizada precalentada al centro de la membrana de la columna blanca. Deje que la membrana se empape durante un minuto a temperatura ambiente.
A continuación, centrifugar el tubo con la columna a 14.000 g durante un minuto a temperatura ambiente. Deseche la columna y almacene el producto de PCR purificado durante un máximo de 12 meses a menos de 20 grados centígrados. Opcionalmente, las imprimaciones inversas COX1 o ND también se pueden utilizar para la secuenciación bidireccional.
Para la secuenciación de Sanger, utilice la imprimación de avance COX1 o ND correspondiente. Después de recuperar los resultados de la secuenciación, compare las secuencias con la secuencia del genoma de la cepa de referencia de ostras del Pacífico utilizando la herramienta en línea NCBI Nucleótida BLAST. Utilice las imprimaciones respectivas hacia adelante y hacia atrás de los genes MgUGD y MgUXS para amplificar y purificar por PCR como se hizo anteriormente.
Después de incubar productos de PCR purificados con tampón de digestión, prepare el vector pET-30a predigerido disolviendo 500 nanogramos de pET-30a en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros y agregue agua desionizada para recargar hasta 16 microlitros. A continuación, agregue dos microlitros de tampón de digestión concentrada 10 veces y un microlitro cada una de las 20 unidades de restricción endonuclea Nde1 y Xho1 en el tubo. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante tres horas.
Después de eso, agregue un microlitro de fosfatasa alcalina de una unidad, e incubar a 37 grados Celsius durante una hora adicional. A continuación, coloque el tubo en un calentador de bloque de metal precalentado a 75 grados Celsius durante 10 minutos para inactivar la fosfatasa alcalina. Después de cultivar células E.coli BL21 que llevan los genes MgUGD y MgUXS, transfiera el cultivo a un medio LB de 400 mililitros en un matraz de agitación de dos litros y colóquelo en una coctelera a 200 rpm a una temperatura de 37 grados centígrados.
Después de tres horas, compruebe la densidad óptica de un fotómetro a una longitud de onda de 600 nanómetros y asegúrese de que alcanza una absorción de aproximadamente 0,5. A continuación, reduzca la temperatura del agitador a 20 grados centígrados. Añadir 400 microlitros de IPTG de un molar para inducir la expresión de las proteínas recombinantes durante tres horas.
Después de cosechar las células, interrumpir las células por sonicación durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Centrifugar a 14.000 veces g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos, y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo para la prueba de actividad. Después del ensayo de actividad, apague las reacciones añadiendo 20 microlitros de metanol y 40 microlitros de cloroformo a las mezclas MgUXS y MgUGD.
Vórtice las mezclas de muestras, y centrifugar a 14.000 veces g durante seis minutos y cuatro grados centígrados. Recoja la capa acuosa superior de cada tubo en nuevos tubos para espectrometría de masas MALDI-TOF. En este experimento, se comparó la alineación de secuencia de las secuencias genéticas COX1 y ND de un espécimen altamente divergente con la cepa de ostras del Pacífico de referencia.
Las flechas rojas muestran diferencias de nucleótidos entre la secuencia de referencia y la secuencia de las muestras de ADNc obtenidas. Las secuencias de los genes COX1 y ND de un espécimen de ostra estrechamente relacionado muestran una baja divergencia con la cepa de ostras del Pacífico de referencia. La espectrometría de masas MALDI-TOF muestra la aplicación exitosa de la biblioteca cDNA para clonar los genes industrialmente relevantes MgUGD y MgUXS.
La imagen de gel también identifica el ácido UDP-glucurónico y UDP-xilosa generado por la acción enzimática de los sucesivamente expresados y purificados MgUGD y MgUXS. Este método no requiere una coincidencia perfecta entre la secuencia de referencia y las secuencias de marcadores obtenidas y debe dar al investigador confianza para trabajar con ostras sin referencia. En principio, este método se puede aplicar a cualquier muestra biológica sin referencia para la que se disponga públicamente de secuencias de una especie de referencia estrechamente relacionada.
Este método permite a los investigadores no expertos acceder fácilmente a material genético de importancia biológica potencial y allana el camino para que más científicos trabajen con muestras biológicas de fácil acceso pero incompletamente identificadas.
