Die Schlüsselfrage, die wir mit dieser Methode angehen wollen, ist, wie wir RNA-Proben aus Material verwenden können, das auf lokalen Lebensmittelmärkten für das Klonen biotechnologisch relevanter Gene gekauft wurde. Hier verwenden wir pazifische Austern als Fallstudie, um diesen Ansatz und mögliche weitere Anwendung zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die konventionelle Genom- oder cDNA-Sequenzierung der Austernproben umgangen werden kann.
Stattdessen wurden Sequenzen der Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit I und der NADH-Dehydrogenase mit öffentlich zugänglichen Referenzsequenzen aus der pazifischen Auster verglichen, um die am engsten verwandte Probe auszuwählen. Die aus dieser Probe hergestellte cDNA kann direkt zum Klonen biotechnologisch relevanter Gene verwendet werden, die anhand der öffentlichen Sequenzinformationen ausgewählt werden können. Demonstriert wird das Verfahren von Yongmei Lyu und Yuquan Li, zwei Doktoranden des Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center an der Nanjing Agricultural University.
Um austerngewebeprobe vorzubereiten, verwenden Sie ein sterilisiertes Skalpell, um etwa 100 Milligramm homogenes Weichgewebe aus dem ungefähren geometrischen Zentrum jeder Austernprobe zu schneiden. Die Probe in einen Mörtel geben, der mit 50 Milliliterflüssigstickstoff gefüllt ist. Das blitzgefrorene Austerngewebe zu einem feinen Pulver zermahlen.
Wiegen Sie 75 Milligramm des gefrorenen Gewebes jeder Probe in ein steriles 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr und mischen Sie es mit einem Milliliter Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Extraktionsreagenz. Der kritischste Schritt dieses Verfahrens ist der RNA-Extraktionsschritt. Um den ABBAU der RNA zu minimieren, ist es wichtig, die Zeit zwischen der Ernte des Austerngewebes und der RNA-Extraktion zu reduzieren.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 mal g und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr geben, 200 Mikroliter Chloroform hinzufügen und 10 bis 15 Sekunden lang auf einem Wirbelmischer gründlich mischen, bis die Mischung milchig weiß wird. Als nächstes Zentrifuge für 15 Minuten wie zuvor getan.
Mit einer 200-Mikroliter-Pipette die obere wässrige Schicht vorsichtig in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen, ohne die Interphase zu stören. 500 Mikroliter Isopropylalkohol in das Zentrifugenrohr geben und vorsichtig umkehren, um die Proben zu mischen. Dann lassen Sie die Proben auf Eis für 20 Minuten.
Zentrifuge bei 14.000 mal g und vier Grad Celsius für acht Minuten, und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in einem Milliliter 75% Ethanol und Zentrifuge bei 14 000 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten wieder aufsetzen. Entfernen Sie den gesamten Überstand, und wiederholen Sie die Wäsche in Ethanol.
Trocknen Sie die Pellets für sechs Minuten bei Raumtemperatur. Lösen Sie dann das getrocknete RNA-Pellet in 25 Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser auf und halten Sie die Röhre auf Eis. Verwenden Sie die RNA-Proben innerhalb von 24 Stunden.
Um eine cDNA-Bibliothek zu erzeugen, bereiten Sie zunächst eine Reaktionsmischung für jede RNA-Probe in einer 300-Mikroliter-PCR-Röhre vor, indem Sie Lösungen entsprechend dem Manuskript hinzufügen. Fügen Sie einen Mikroliter der extrahierten RNA-Probe in die Röhre. Inkubieren Sie die Mischung in einem PCR-Thermocycler für 60 Minuten bei 42 Grad Celsius, und erhöhen Sie dann die Temperatur auf 95 Grad Celsius für fünf Minuten.
Speichern Sie die generierte cDNA-Bibliothek bis zu 12 Monate bei minus 20 Grad Celsius. Fügen Sie zunächst einen Mikroliter der generierten cDNA-Bibliothek zu Denrden hinzu, die PCR-Mischungen enthalten, die gemäß dem Manuskript hergestellt werden. Legen Sie die PCR-Röhren in den PCR-Thermocycler und führen Sie die PCR-Verstärkung mit einem ersten Denaturierungsschritt und 35 PCR-Reaktionszyklen durch, die aus einem Glühschritt, einem Dehnungsschritt und einem Denaturierungsschritt nach dem Manuskript bestehen.
Führen Sie nach den Zyklen einen abschließenden Dehnungsschritt für fünf Minuten durch. Verwenden Sie fünf Mikroliter des PCR-Produkts, um die Qualität durch Agarose-Gel-Elektrophorese zu überprüfen. Beobachten Sie das verstärkte COX1- oder ND-Gen als einzelband bei 759 bzw. 748 Basenpaaren.
Um den Rest des PCR-Produkts zu reinigen, fügen Sie 100 Mikroliter DNA-Bindungspuffer mit hohen Konzentrationen von chaotropen Salzen zu jeder Probe hinzu. Wirbel kurz, um den Inhalt zu mischen. Legen Sie eine Reinigungskolonne in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr.
Pipette das Reaktionsgemisch in die Säule. Legen Sie das Rohr mit der montierten Säule bei Raumtemperatur 14.000 mal g in eine Zentrifuge. Nach dem Wegwerfen des Filtrats aus dem Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr zweimal mit 700 und 400 Mikroliter Waschlösung W2 durch Zentrifugieren bei 14.000 mal g waschen.
Als nächstes erhitzen Sie einen Milliliter entionisiertes Wasser auf 65 Grad Celsius in einer Metallblockheizung. Übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr und Pipette 25 Mikroliter des vorgewärmten deionisierten Wassers in die Mitte der weißen Säulenmembran. Lassen Sie die Membran für eine Minute bei Raumtemperatur einweichen.
Zentrifugieren Sie dann das Rohr mit der Säule bei 14.000 mal g für eine Minute bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Säule, und lagern Sie das gereinigte PCR-Produkt bis zu 12 Monate bei minus 20 Grad Celsius. Optional können die COX1- oder ND-Reverse-Primer auch für die bidirektionale Sequenzierung verwendet werden.
Verwenden Sie für die Sanger-Sequenzierung die entsprechende COX1- oder ND-Vorwärtsgrundierung. Vergleichen Sie nach dem Abrufen der Sequenzierungsergebnisse die Sequenzen mit der Genomsequenz des pazifischen Austernreferenzstamms mit dem Online-Tool NCBI Nukleotid BLAST. Verwenden Sie die jeweiligen Vorwärts- und Reverse-Primer von MgUGD- und MgUXS-Genen, um sie wie bisher durch PCR zu verstärken und zu reinigen.
Nach der Inkubation gereinigter PCR-Produkte mit Verdauungspuffer den vorverdauten pET-30a-Vektor vorbereiten, indem Sie 500 Nanogramm pET-30a in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr auflösen, und deionisiertes Wasser hinzufügen, um bis zu 16 Mikroliter aufzuladen. Fügen Sie dann zwei Mikroliter 10-fach konzentrierten Verdauungspuffer und je einen Mikroliter der 20 Einheiten Restriktionsendonukleasen Nde1 und Xho1 in die Röhre. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für drei Stunden.
Danach einen Mikroliter eineinheitsalkalische Phosphatase hinzufügen und bei 37 Grad Celsius für eine weitere Stunde brüten. Legen Sie dann das Rohr in eine vorgeheizte Metallblockheizung bei 75 Grad Celsius für 10 Minuten, um die alkalische Phosphatase zu inaktivieren. Nach dem Anbau von E.coli BL21-Zellen mit den Genen MgUGD und MgUXS, übertragen Sie die Kultur in ein Zweiliter-Schüttelkolben in ein 400-Milliliter-LB-Medium und legen Sie sie bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius auf einen Shaker bei 200 U/min.
Überprüfen Sie nach drei Stunden die optische Dichte auf einem Photometer bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern und stellen Sie sicher, dass sie eine Absorption von etwa 0,5 erreicht. Dann reduzieren Sie die Schütteltemperatur auf 20 Grad Celsius. Fügen Sie 400 Mikroliter ein-molar IPTG hinzu, um die Expression der rekombinanten Proteine für drei Stunden zu induzieren.
Nach der Ernte der Zellen, stören sie die Zellen durch Beschallung für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Zentrifuge bei 14.000 mal g und vier Grad Celsius für 20 Minuten, und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Rohr für den Aktivitätstest. Nach dem Aktivitätstest die Reaktionen durch Zugabe von 20 MikrolitermEthanol und 40 Mikroliter Chloroform zu den MgUXS- und MgUGD-Mischungen zu löschen.
Wirbel die Probenmischungen, und Zentrifuge bei 14.000 mal g für sechs Minuten und vier Grad Celsius. Sammeln Sie die obere wässrige Schicht jedes Rohres in neuen Rohren für die MALDI-TOF-Massenspektrometrie. In diesem Experiment wurde die Sequenzausrichtung der COX1- und ND-Gensequenzen einer stark divergierenden Probe mit dem Referenz-Pazifischen Austernstamm verglichen.
Die roten Pfeile zeigen Nukleotidunterschiede zwischen der Referenzsequenz und der Sequenz der erhaltenen cDNA-Proben. Die Sequenzen der COX1- und ND-Gene einer eng verwandten Austernprobe zeigen eine geringe Divergenz vom Referenzstamm der pazifischen Austern. Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie zeigt eine erfolgreiche Anwendung der cDNA-Bibliothek, um die industrierelevanten Gene MgUGD und MgUXS zu klonen.
Das Gelbild identifiziert auch UDP-Glucuronsäure und UDP-Xylose, die durch die enzymatische Wirkung der sukzessive exprimierten und gereinigten MgUGD und MgUXS erzeugt werden. Diese Methode erfordert keine perfekte Übereinstimmung zwischen der Referenzsequenz und den erhaltenen Markersequenzen und sollte dem Forscher das Vertrauen geben, mit nicht referenzierten Austern zu arbeiten. Grundsätzlich kann diese Methode auf jede nicht referenzierte biologische Probe angewendet werden, für die Sequenzen einer eng verwandten Referenzart öffentlich zugänglich sind.
Diese Methode ermöglicht nicht-fachkundigen Forschern den einfachen Zugriff auf genetisches Material von potenzieller biologischer Bedeutung und ebnet mehr Wissenschaftlern den Weg, mit leicht zugänglichen, aber unvollständig identifizierten biologischen Proben zu arbeiten.
