שאלת המפתח שאנו רוצים להתייחס אליה בשיטה זו היא כיצד נוכל להשתמש בדגימות RNA מחומר שנרכש בשוקי מזון מקומיים לשיבוט גנים רלוונטיים ביוטכנולוגיה? כאן, אנו משתמשים צדפות האוקיינוס השקט כמקרה מבחן להדגמת גישה זו ויישום נוסף פוטנציאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי גנום קונבנציונלי או רצף cDNA של דגימות צדפות ניתן לעקוף.
במקום זאת, רצפים של ציטוכרום c אוקסידאז subunit אני NADH דהידרוגנאז הושוו עם רצפי התייחסות זמינים לציבור מן הצדפה האוקיינוס השקט כדי לבחור את הדגימה הקשורה ביותר. ה- cDNA שהוכן מדגימה זו יכול לשמש ישירות לשיבוט של גנים רלוונטיים ביוטכנולוגיה, אשר ניתן לבחור באמצעות מידע הרצף הציבורי. הדגמת ההליך יהיו יונגמיי ליו ויוקוואן לי, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמרכז לחקר הגליקומיקה והביו-הנדסה הגליקנית באוניברסיטה החקלאית של נאנג'ינג.
כדי להכין דגימת רקמת צדפה, השתמש אזמל מעוקר לחתוך כ 100 מיליגרם של רקמה רכה הומוגנית מהמרכז הגיאומטרי המשוער של כל דגימת צדפה. מעבירים את הדגימה למרגמה מלאה ב-50 מיליליטר של חנקן נוזלי. טוחנים את רקמת הצדפה הקפואה לאבקה דקה.
שוקלים 75 מיליגרם של הרקמה הקפואה של כל דגימה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר, ומערבבים עם מיליליטר אחד של ריאגנט מיצוי גואנידיניום תיוצ'יאנט-פנול. השלב הקריטי ביותר של הליך זה הוא שלב החילוץ RNA. על מנת למזער השפלה RNA, זה חיוני כדי להפחית את הזמן בין קצירת רקמת הצדפה ואת מיצוי RNA.
צנטריפוגה המדגם ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבבים היטב על מערבל מערבולת במשך 10 עד 15 שניות עד שהתערובת הופכת ללבנה חלבית. לאחר מכן, צנטריפוגה במשך 15 דקות כפי שנעשה בעבר.
עם פיפט 200 מיקרוליטר, בזהירות להעביר את השכבה המים העליונה, מבלי להפריע interphase, לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אלכוהול isopropyl לתוך צינור צנטריפוגה, ולהפוך בעדינות כדי לערבב את הדגימות. ואז להשאיר את הדגימות על קרח במשך 20 דקות.
צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות, ולהסיר את supernatant. תן את הכדור במיליליטר אחד של 75%אתנול, וצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את כל העל-טבעי, וחזור על הכביסה באתנול.
יבש את כדורי במשך שש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ממיסים את גלולת ה-RNA המיובשת ב-25 מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC, ומרחיקים את הצינור על הקרח. השתמש בדגימות ה-RNA תוך 24 שעות.
כדי ליצור ספריית cDNA, תחילה להכין תערובת תגובה עבור כל דגימת RNA בצינור PCR 300 מיקרוליטר על ידי הוספת פתרונות על פי כתב היד. הוסף מיקרוליטר אחד של דגימת RNA שחולצו לתוך הצינור. הדגירה את התערובת בתרמוצ'ילי PCR במשך 60 דקות ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להגדיל את הטמפרטורה ל 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
אחסן את ספריית cDNA שנוצרה עד 12 חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. ראשית, להוסיף מיקרוליטר אחד של ספריית cDNA שנוצר צינורות המכילים תערובות PCR, מוכן על פי כתב היד. מקם את צינורות PCR לתוך התרמוצ'ילר PCR, ולבצע את הגברה PCR עם שלב denaturation הראשונית 35 מחזורי תגובה PCR המורכב שלב חישול, צעד התארכות, צעד denaturation על פי כתב היד.
לאחר המחזורים, לבצע צעד אחד סיום התארכות במשך חמש דקות. השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR כדי לאמת את האיכות על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. שימו לב לגן COX1 או ND המוגבר כרצועה אחת ב-759 או 748 זוגות בסיסים, בהתאמה.
כדי לטהר את שאר המוצר PCR, להוסיף 100 microliters של מאגר מחייב DNA המכיל ריכוזים גבוהים של מלחים chaotropic לכל מדגם. מערבולת בקצרה כדי לערבב את התוכן. מניחים עמוד טיהור לתוך צינור צנטריפוגה שני מיליליטר.
פיפטה תערובת התגובה לתוך הטור. מניחים את הצינור עם העמוד רכוב בצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסינון מצינור הצנטריפוגה שני מיליליטר, לשטוף פעמיים עם 700 ו 400 microliters של פתרון כביסה W2 על ידי צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם.
לאחר מכן, מחממים מיליליטר אחד של מים deionized ל 65 מעלות צלזיוס בתנור בלוק מתכת. העבר את העמודה לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, ולצינור פיפטה 25 מיקרוליטר של המים שחומם מראש למרכז קרום העמוד הלבן. תן את הממברנה להשרות במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור עם העמוד ב 14, 000 פעמים גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. יש להשליך את העמודה ולאחסן את מוצר ה-PCR המטוהר למשך עד 12 חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. באופן אופציונלי, ניתן להשתמש בפרימרים ההפוכים COX1 או ND גם עבור רצף דו-כיווני.
עבור רצף סנגר, השתמש ב- COX1 או ב- ND קדימה הרלוונטי. לאחר אחזור תוצאות הרצף, השווה את הרצפים עם רצף הגנום של זן הייחוס של צדפות האוקיינוס השקט באמצעות הכלי המקוון NCBI Nucleotide BLAST. השתמשו בפרימרים קדמיים והפוךים בהתאמה של גנים MgUGD ו-MgUXS כדי להגביר ולטהר על ידי PCR כפי שנעשה בעבר.
לאחר הדגירה מוצרי PCR מטוהרים עם חיץ עיכול, להכין את וקטור pET-30a predigested על ידי המסת 500 ננוגרם של pET-30a בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ולהוסיף מים deionized למעלה עד 16 microliters. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של מאגר עיכול מרוכז פי 10 ומיקרוליטר אחד לכל אחד מ-20 היחידות המצילות אנדונוקלאס Nde1 ו-Xho1 לתוך הצינור. להחגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות.
לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פוספטאז אלקליין יחידה אחת, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת. לאחר מכן, מניחים את הצינור בתנור בלוק מתכת שחומם מראש ב 75 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשבית את הפוספטזה אלקליין. לאחר טיפוח תאי E.coli BL21 הנושאים את הגנים MgUGD ו- MgUXS, מעבירים את התרבות למדיום LB של 400 מיליליטר בבקבוק רועד של שני ליטרים, ומ מניחים אותו על שייקר במהירות של 200 סל"ד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שלוש שעות, לבדוק את הצפיפות האופטית על פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר, ולוודא שהוא מגיע לספיגה של כ 0.5. לאחר מכן להפחית את טמפרטורת השייקר ל 20 מעלות צלזיוס. הוסף 400 microliters של IPTG טוחן אחד כדי לגרום לביטוי של חלבונים רקומביננטי במשך שלוש שעות.
לאחר קצירת התאים, לשבש את התאים על ידי sonication במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 14, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, ולאסוף את supernatant בצינור חדש לבדיקת הפעילות. לאחר בדיקה פעילות, להרווה את התגובות על ידי הוספת 20 microliters של מתנול ו 40 microliters של כלורופורם לתערובות MgUXS ו MgUGD.
מערבולת תערובות מדגם, וצנטריפוגה ב 14, 000 פעמים גרם במשך שש דקות וארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את השכבה הממימייה העליונה של כל צינור בצינורות חדשים עבור ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF. בניסוי זה, יישור רצף של רצפי הגנים COX1 ו- ND של דגימה מפוצלת מאוד הושוו עם זן הצדפות הפסיפי התייחסות.
החצים האדומים מראים הבדלי נוקלאוטיד בין רצף ההתייחסות לבין רצף דגימות cDNA שהתקבלו. הרצפים של הגנים COX1 ו- ND של דגימת צדפות קשורה קשר הדוק מראים סטייה נמוכה מזן הצדפות הפסיפי התייחסות. ספקטרומטריית המסה MALDI-TOF מציגה יישום מוצלח של ספריית cDNA לשיבוט הגנים הרלוונטיים לתעשייה MgUGD ו- MgUXS.
תמונת הג'ל מזהה גם חומצה UDP-glucuronic ו UDP-xylose שנוצר על ידי הפעולה אנזימטית של MgUGD ומטוהרים ברציפות MgUGD ו MgUXS. שיטה זו אינה דורשת התאמה מושלמת בין רצף הייחוס לבין רצפי הסמן המתקבלים ואותה לתת לחוקר ביטחון לעבוד עם צדפות לא קשורות. באופן עקרוני, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מדגם ביולוגי שלא הותר עבורו רצפים ממין ייחוס קרוב זמינים לציבור.
שיטה זו מאפשרת לחוקרים שאינם מומחים לגשת בקלות לחומר גנטי בעל חשיבות ביולוגית פוטנציאלית וסוללת את הדרך עבור מדענים נוספים לעבוד עם דגימות ביולוגיות נגישות אך מזוהות באופן לא שלם.
