Bu yöntem, kıkırdak rejenerasyonu için kullanılabilecek yerli dokudan elde edilen iskeleler oluşturmak için bir yol sunar. Bu tekniğin en büyük avantajı, doğal kıkırdak bileşenlerinin, kıkırdak oluşumunu ve in vitro ve in vivo rejenerasyonu teşvik eden iskelelerde korunmasıdır. Bu yöntem at besmeleden kıkırdak kullanılmasına rağmen, diğer eklemlerden gelen kıkırdak da kullanılabilir.
Başlamak için, kıkırdak izolasyonu için sağlam bir kadavra eklem elde etmek ve eşlik eden metin protokolü açıklandığı gibi deri aşırı yağ ve kas dokusu kaldırın. Daha sonra, eklem uzantısı çekim gerçekleştirerek eklem ifade yerini tanımlayın. Eklem boşluğuna ulaşmak için yatay bir kesi yapın.
Sonra, ortak alanı açmak için dikey bir kesi yapın. Eklem boşluğu muhtemelen doğru kesi yaparken boşluktan damla olacak sinovyal sıvı ile doldurulur. Aşırı yağ, kas ve tendonları kaldırarak ve eklemi bir arada tutan tendonları keserek eklemi tamamen açmaya devam edin.
Herhangi bir makroskopik hasar için kıkırdağı dikkatlice inceleyin. Eklem kıkırdağı parlak pürüzsüz bir görünüme sahip değilse veya kanıt, kabarcık, yarık veya kusurları varsa, kıkırdak atın ve yeniden başlayın. Kemik kıkırdak kaldırmak için steril bir neşter kullanın.
Derin bölge kıkırdağını çıkarmak için subkondral kemiğe kadar kesin. Daha önce hazırlanmış kıkırdak yıkama çözeltisi içeren 50 mililitretüpler de kaldırılan kıkırdak dilimleri toplayın. İşlenirken, kıkırdak kurumasını önlemek için kıkırdak üzerine düzenli olarak kıkırdak yıkama çözeltisi damlatın.
Tüm ilgi alanlarından kıkırdak topladıktan sonra, kıkırdak dilimlerini sıvı nitrojende beş dakika dondurun. Sonra 50 mililitretüpler içine kıkırdak dilimleri aktarın ve hemen bir dondurucu kurutucu dondurulmuş dilimleri yerleştirilir. Kıkırdak dilimlerini dondurularak 24 saat boyunca kurutucu ile lyophilize.
Bittiğinde, oda sıcaklığında kuru bir yerde dondurulmuş kurutulmuş kıkırdak dilimleri saklayın. Manuel işleme için, sıvı nitrojen ile bir harç ve havaneli önceden soğutun, sonra harç içinde lyophilized kıkırdak dilimleri yerleştirin ve onları ve sıvı nitrojen batırın. Numuneleri yeterince toz haline gelene kadar yaklaşık 45 dakika elle doğrudan öğütün.
Alternatif olarak, numuneleri bir frezeleme makinesi kullanarak otomatik olarak öğütmek için, frezeleme makinesinin öğütme bölmesini sıvı nitrojen ekleyerek önceden soğutmadan başlayın. Daha sonra lyophilized kıkırdak dilimleri ekleyin ve bir dakika kadar birkaç saniye için önceden ayarlanmış hızda örnek değirmen. Tüm parçacıkların toprak olduğundan ve taşlama bölmesinin altında hiçbir parçacığın kalmadığından emin olun.
Son olarak, iskele oluşturmadan önce eşlik eden metin protokolünde açıklanan hücredışılaştırma tekniğini uygulayın. Küçük etiketli kıkırdak partiküllerini silindirik plastik kalıba aktarın. İskeledeki boşlukları önlemek ve kalıbı tamamen doldurmak için tüm hava kabarcıklarını dışarı bastırın.
İskelelerde boşlukları önlemek için, hava kabarcıkları kıkırdak parçacıkları ile kalıp doldururken dışarı preslenmiş olduğundan emin olun. Oluşumundan sonra, eksi 20 santigrat derece 10 dakika kalıp dondurun. Daha sonra bir dondurucu kurutucu içinde 24 saat boyunca kalıp içinde kıkırdak iskeleler lyophilize.
Lyophilization sonra, dikkatle kalıp iskele kaldırın. 365 nanometre dalga boyu UV ışık altında iskele yerleştirin ve bir gecede çapraz bağlantı. Sterilize edilmiş iskeleleri üç milimetre kalınlığında dilimler halinde keserek iskele diskleri oluştur.
Sonra altı kuyu plaka ayrı kuyular içine iskeleler aktarın. İskelelerin üstüne bir mililitre Chondrocyte Genleşme Ortamı ekleyin ve 30 dakika boyunca yeniden su döşeymelerini bekleyin. İskeleler rehydrate iken, önceden ıslatılmış iskele üstüne hazırlanan hücre süspansiyon hücreleri ve pipet 50 mikrolitre hazırlamak.
Sonra 37 santigrat derecede bir saat iskele kuluçka. Kondrosit kullanırken, farklılaşmış hücrelerin sayısını en aza indirmek için ilk geçit geçmiş genişletilmiş olmadığından emin olun. Bir saat sonra, plakayı kültür başlığına geri getirin ve iskeleyi dikkatlice ters çevirin.
Pipet, kalan 50 mikrolitre hücre süspansiyonu iskelede ve 37 santigrat derecede bir saat daha kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, iskeleler ile kuyulara üç mililitre orta ekleyin. Ortamı doğrudan iskelelerin üzerine borulamaktan kaçının ve hücrelerin ayrılmasını önlemek için kültür plakasını nazikçe işleyebilirsiniz.
Plakayı 37 santigrat derecedeki kuvöz ve kültür hücresi iskelelerine geri ver. Bu makalede sunulan yöntemlerin yeterli kıkırdak iskele decellularization neden olduğunu göstermek için histolojik boyama ve DNA niceliği bir arada kullanılmıştır. Ortaya çıkan iskelelerde tespit edilemeyen DNA seviyeleriile birlikte hiçbir hücre bulunmadığı tespit edildi.
Onlar da glikozaminoglikaneksikliği ve kollajen II.Here açısından zengin, neo matriks oluşumu iskele dört hafta boyunca kültürlü olan mezenkimal kök hücreleri ile ceded gözlenir. Glikozaminoglikan oluşumu dört hafta sonra boldur. Bu yordamı denedikten sonra, herhangi bir uygulamada kullanmadan önce, hücre dışılaştırmanın başarılı olup olmadığını incelemek önemlidir.
Bu prosedürü takiben, büyüme faktörleri gibi diğer bileşenlerin varlığı ile ilgili belirli soruları cevaplamak için Batı leke analizörü gibi ek biyokimyasal analizler yapılabilir. Bu teknik, doku mühendisliği alanında araştırmacıların allojeneik ve singenik kaynaklardan hücreli doku kullanarak kıkırdak rejenerasyonu için stratejiler keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
