Bu protokol, Drosophila melanogaster larvalarının çeşitli bağışıklık ve moleküler çalışmalar için bir model olarak kullanılmasına izin verecek kesin bir yöntem tanımlayarak mikroenjeksiyon larvaları ile ilgili zorlukları ve zorlukları ele almaktadır. Bu, çeşitli maddeleri tekrar tekrar tek tip bir şekilde sunmak için verimli, uygun maliyetli ve hızlı bir yöntem sunan ve tutarlı ve güvenilir sonuçlar veren basit bir enjeksiyon tekniğidir. Üçüncü instar aşaması larvalarını seçerek ve bunları küçük bir Petri kabında Ringer'ın çözeltisiyle yıkayarak başlayın.
Bir Petri kabına bir filtre kağıdı yerleştirin ve 5 ml Ringer çözeltisi ile nemlendirin. Sonra larvaları filtre kağıdına yerleştirin. Bir mikropipet çektirmede 3,5" cam kılcal tüpler kullanarak kılcal damarlar hazırlayın.
Cam kılcal damarı düz tırtıklı orta nokta forseps yardımıyla açın. Açık kılcal damarı plastik tek kullanımlık bir şırınga kullanarak mineral yağ ile doldurun. Ardından, yağı nanolitrelik bir enjektör ile kılcal borudan çıkarın.
Kılcal damarı enjeksiyon için istenen bakteriyel preparatla doldurun. Anestezi altındaki larvaları Ringer çözeltisi ile nemlendirilmiş bir filtre kağıdına aktarın. Forseps kullanarak, trakeal spiracles'in belirgin olduğu larvaların arka ucunun dorsal tarafına sıkı baskı uygulayın.
Ardından, iğneyi larvaların arka ucuna doğru yatay olarak yerleştirin ve bakteri stoklarını enjekte edin. Hemolenf veya bağırsağın dökülmesini önlemek için forsepsleri çıkarın. Ardından, daha önce larvalara yerleştirilen iğneyi geri çekin.
Her deneysel durum için 20 larva enfekte edin. Bir boya fırçası kullanarak, enjekte edilen larvaları yavaşça ayrı bir nemli filtre kağıdına aktarın. Kurulaşmayı önlemek için gerektiğinde Ringer çözeltisini ekleyin.
Petri kabını 25 C'de bir inkübatörde inkübe edin Photorhabdus asymbiotica ile enfekte olmuş Drosophila melanogaster larvaları, enjeksiyondan sonraki 24 saat boyunca% 57'lik bir hayatta kalma oranı sergilerken, Escherichia coli ile enjekte edilen larvalar aynı zamanda% 85'lik bir hayatta kalma oranı göstermiştir. Bu yöntemin önemi, iğnenin larvaya yaklaşık olarak paralel tutulmasıdır. Larvaları tutmak için uygulanan basınç çok azdır, bu da hemolenf sızıntısı, ölümcül yaralanma veya istenen maddenin yetersiz verilmesi olasılığını azaltır.
Bu teknik uygulama ile mükemmelleştirilebilir.
